督脉电针调控lncRNA H19-HNRNPU信号轴促进脊髓可塑性的作用及机制研究

The pathogenesis of spinal cord injury is complicated and the curative effect is poor, which brings a heavy burden to the patients' families. Previous study found that the Governor Vessel electro-acupuncture can improve sensory, motor and spinal cord electrophysiological function . But the mechanism remains obscure. Through high-throughput sequencing, we previously found that the promotion of spinal cord plasticity was positively correlated to lncRNA H19 expression. Antisense affinity enrichment experiments suggested that H19 and HNRNPU could form RNA-protein complexes. And recently, no relevant reports on spinal cord injury have been found yet. This project intends to further use this as a starting point to explore the mechanism that the RNA-protein complex regulates neural plasticity through downstream CRMPs family members by means of adeno-associated virus regulation and cross-linked immunoprecipitation (CLIP). From the molecule-cell-overall behavior perspective, this project aims to reveal new mechanism of functional recovery of the injured spinal cord following electro-acupuncture treatment and provide a beneficial target for exploration of new neurotrophic drugs.

脊髓损伤发病机制复杂，目前疗效不佳，给病患家庭带来沉重负担。本项目前期研究发现，督脉电针可以改善感觉、运动和脊髓电生理功能，然而机制尚不明确。我们前期通过高通量测序发现其促进脊髓可塑性与lncRNA H19的表达含量正相关。反义亲和富集实验提示H19与HNRNPU形成RNA-蛋白复合物。目前在脊髓损伤中尚未见它们的相关报道。本项目拟进一步以此为切入点，通过腺相关病毒调控、交联免疫共沉淀（CLIP）等方法探究该RNA-蛋白复合物通过下游CRMPs家族分子调控神经可塑性的机制，以期从分子-细胞-整体行为角度揭示督脉电针促进损伤脊髓功能重建的新机制，为研发新型促神经修复药物提供有益靶标。

本课题为反向检测HNRNPU是否与H19结合，进一步使用HNRNPU的抗体进行Pulldown实验。在对Pulldown样本进行RT-PCR的结果中并未检测到H19的信号。与此同时我们还构建了H19的条件性敲除鼠，在进行督脉电针后大鼠的行为学没有显著性变化。这些结果说明H19在督脉电针引起的脊髓损伤恢复中可能没有关键作用。根据课题组研究基础，我们决定及时调整战略对电针对神经系统疾病的治疗作用以及脑缺血导致的中枢神经系统损伤进行研究。我们建立大鼠术后认知功能障碍模型，给予电针干预，采用 Morris 水迷宫， RT- PCR，Western blot和TUNEL 等方法，结果提示电针改善认知功能障碍大鼠学习记忆功能，其机制可能与下调海马组织中 HIF-1α 的表达，进而抑制神经细胞凋亡有关。.项目执行过程中我们还在小鼠脑缺血模型中，利用脂质组学分析，条件敲除小鼠，RNA测序和RNA pull-down等手段，证实了一种相互竞争的内源性RNA途径参与调节膜稳态进而影响脑缺血损伤中细胞存活。为进一步深入研究，我们培养了人和大鼠脑微血管内皮细胞进行氧糖剥夺，随后收集胞外囊泡进行RNA测序。对差异的LncRNA进行功能分析发现这些LncRNA可能参与炎症相关通路或与炎症信号密切相关。后续我们对人和大鼠脑血管内皮细胞胞外囊泡的差异LncRNA进行了保守性分析，获得了三个同源性较高的LncRNA。在小胶质细胞中高表达其中同源性最高的NR_002323.2，发现显著引起小胶质细胞的M1型激活。目前我们正在构建NR_002323.2的敲除鼠，以期进一步证实NR_002323.2在脑缺血炎症反应中的作用及其机制。项目资助发表论文3篇。培养研究生1名。项目投入经费34万元，支出20.8815万元，各项支出基本与预算相符。剩余经费13.1185万元，剩余经费计划用于本项目研究后续支出。