植物介导的RNAi沉默致病疫霉基因的有效性研究

致病疫霉具有极强的进化潜力，能迅速克服寄主的抗性基因，导致抗病品种很快丧失抗性，使得马铃薯抗晚疫病育种举步维艰。为探索植物介导的RNAi沉默致病疫霉基因表达的有效性，开辟马铃薯抗晚疫病育种新途径，本研究拟分别构建以致病疫霉单拷贝的翻译延伸因子tef1为靶标的RNAi载体、以多拷贝的gpi基因为靶标的RNAi载体和同时以4个致病疫霉纤维素合成酶基因（ces）为靶标的RNAi载体，然后采用农杆菌介导法分别将这三个载体导入晚疫病易感马铃薯，通过接种病原菌后转基因马铃薯与野生型马铃薯侵染斑部位致病疫霉tef1、gpi及4个ces基因的表达水平分析，阐明植物介导的RNAi抑制侵染马铃薯的致病疫霉特定基因表达的有效性。本研究的开展将为马铃薯抗晚疫病育种提供新策略，同时为植物抗真核病原微生物胁迫和植物-病原菌互作研究提供新思路。

由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的晚疫病是马铃薯最具毁灭性的病害。为明确植物介导的RNAi沉默致病疫霉基因的有效性，探索晚疫病抗性育种新途径，本研究采用PCR技术分别克隆了晚疫病菌tef1、gpi、和chi基因干扰片段tef、gpi和chi;采用重叠延伸PCR技术克隆了同时与晚疫病菌4个ces基因均同源的融合基因C1234。然后以pHANNIBAL和pART27为基础，分别构建了内含子连接的tef、gpi、chi和C1234反向重复序列植物表达载体pATIV、pAGIV、pACHIV和pACIV。采用农杆菌介导法转化晚疫病易感马铃薯品种大西洋，经PCR和Southern杂交检测，获得了80个转pATIV株系、48个转pAGIV株系、73个转pACHIV株系和129个转pACIV株系。转基因植株离体叶片接种病原菌后，所有叶片均被致病疫霉感染，呈现晚疫病典型症状。但转pACIV的植株中有97个株系发病速度明显慢于野生型，病原菌接种6d后病斑大小和霉层厚度均明显小于对照，并且叶片感病部位没有出现失绿斑，而野生型产生了明显的失绿斑。实时定量RT-PCR分析发现，绝大部分转基因植株能够中等程度的下调靶标基因的表达，表达量下调幅度最大的基因表达水平为野生型的48%。本研究表明在马铃薯中表达dsRNA能够引起入侵致病疫霉中与其同源的单个或多个基因表达下调，并且同时下调4个ces基因表达能够延缓晚疫病发病进程。本研究证实，采用植物介导的RNAi能够有效下调致病疫霉基因表达，作为一种新的抗晚疫病育种策略是可行的。