肺孢子虫肺炎诊断新方法及肺泡上皮细胞凋亡机制研究

Pneumocystis pneumonia (PCP), caused by the opportunistic fungal agent Pneumocystis carinii, has been known for many years to be a disease of immunocompromised persons. Pneumocystis (PC) causes little or no disease after infecting a normal host, while infection of the immunocompromised host results in a uniformly fatal pneumonia if untreated. The study of Pneumocystis has been problematic due to the inability to cultivate the organism or manipulate its cellular or molecular characteristics. The requirement for invasive procedures to obtain respiratory specimens for microscopic examination identify Pneumocystis pneumonia as an attractive target for molecular diagnosis. For years, diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia has relied on microscopic visualization of PC in specimens obtained from the lung either by bronchoalveolar lavage or by induction of sputum. But the sensitivity of conventionally stained specimens is variable. Hence, convenient, stable, sensitive and specific diagnostic procedures are needed for patients with PCP. As such, in this current study, using a combination of difference gel electrophoresis (DIGE) and mass spectrometry, we seek biomarkers that can forecast hazard or diagnose the PCP by testing body fluid and tissue of PC infected rat.It helps us to identify the dynamic change of proteins in the different level and different source. Thus, it is beneficial to reveal the molecular fundation of the body responding to the PC infection. Combining co-culture of PC, type Ⅱ alveolar epithelial cell and lymphocyte with molecular biological techniques, we detect the molecular mechanisms of lung injury over the course of Pneumocystis pneumonia. Understanding the basic biology and function of Pneumocystis as a pathogen will aid in developing means to prevent PCP.

肺孢子虫（PC）为单细胞真核生物，是普遍存在哺乳动物肺部的机会致病性病原体，在宿主免疫抑制情况下增殖，可引起免疫抑制宿主发生肺孢子虫肺炎（PCP），严重者导致患者死亡。PC感染后，使肺泡微环境，包括组织结构和生化代谢发生一系列复杂的变化，其机制尚不明确。鉴于此，我们拟采用DIGE技术与生物质谱相结合的方法，通过检测受感染大鼠的体液及组织产生的特征性代谢产物,不仅获得不同组织水平的蛋白表达变化，而且对这些表达变化的蛋白分子的反应源性进行了追踪，从而，有利于筛选具有临床预警或诊断PCP的生物标志分子，并有利于阐明PCP发生、发展以及由此导致对机体局部、全身的损伤反应的分子机制，揭示PC诱发的机体组织、细胞、体液应答的分子基础。通过PC与淋巴细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞共培养，结合分子生物学实验技术，研究PC或其诱发的免疫反应对肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤机制，从而加深对肺孢子虫肺炎的诊治和发病机制的认识。

肺孢子虫(Pneumocystis, PC)为单细胞真核生物，是普遍存在哺乳动物肺部的机会致病性病原体，可在免疫功能低下的人群中诱发致命性的肺孢子虫肺炎（Pneumocystis pneumonia, PCP）。自发现AIDS以来，PCP已成为其最重要的并发症和最主要的致死原因。其它如器官移植、恶性肿瘤、白血病、自身免疫性疾病等都可发生PCP，其发病率呈明显上升之势，已引起越来越多的关注。PC感染后，使肺泡微环境，包括组织结构和生化代谢发生一系列复杂的变化，其机制尚未明确。同时，PCP患者症状重、体征轻，发病迅速，病死率高，临床表现不具特异性。因此，加强对肺孢子虫肺炎发病机制的认识以及建立敏感性高、特异性强和易于接受的诊断方法是至关重要的。鉴于此，我们通过腹股沟皮下注射地塞米松注射液，建立肺孢子虫感染Wistar大鼠动物模型，并研究PC感染引起的大鼠肺脏、肝脏及脾脏组织病理变化。运用液态芯片技术，检测PC感染大鼠血清、肺泡灌洗液中11种细胞因子的改变情况，研究宿主免疫系统应对PC感染的免疫应答机制。采用TMT标记结合二维高效液相色谱/串联质谱联用的技术对正常对照组Wistar大鼠和肺孢子虫感染Wistar大鼠的血清、肺组织、肺泡灌洗液进行差异蛋白质组学分析，共鉴定到定量差异倍数≥1.5倍的血清蛋白质21个、肺组织蛋白质116个、肺泡灌洗液蛋白质339个。同时，对鉴定到的差异蛋白质进行生物信息学分析。综上，本研究通过差异蛋白质组学技术筛选获得一系列PC感染导致的体液、组织蛋白质表达变化，是迄今为止检索到的最大规模的PC感染所致的差异蛋白质组学分析，同时，首次系统研究了PC感染引起的大鼠肝、脾、肺组织病理变化及体液细胞因子变化，该数据对推进肺孢子虫的损伤机制研究具有重要意义。