Amh调控斜带石斑鱼性逆转的功能及分子机制研究

The orange-spotted grouper, Epinephelus coioides, is a favorite marine food fish and a protogynous hermaphroditic teleost. Sex reversal is a complex event and its mechanism remains elusive in groupers. Anti-Müllerian hormone (Amh), a member of the transforming growth factor-β family, signaling through Smads protein. Research reports that Amh is an important factor of male determination and gonad differentiation. In our experiment we found the expression of amh in male after sex reversal is higher >100 fold than that in female before the sex reversal. Bioinformatics analysis revealed that the promoter of Amh target gene cyp19a1a contains Smad binding sites. Based on this information, this program will try to understand the gene structure and expression profiles of grouper Amh gene, its impact on the sex reversal and its possible regulatory pathway Amh-Smads-Cyp19a1a, thus to identify the function of the Amh gene, and explain its role and mechanism in the sex reversal of orange-spotted grouper. The results will help us understand the molecular regulation mechanism of sex reversal in marine fish, deepen the understanding of sex reversal of this kind of life phenomenon, and in future provide scientific guidance for the innovation of grouper culture technology.

斜带石斑鱼是重要的海水经济鱼类，为典型的雌雄同体雌性先熟鱼类。石斑鱼有复杂的性逆转现象，其分子机制还不是很明确。Amh（anti-Müllerian hormone）是TGF-β家族成员，由Smads传递信号。研究表明Amh参与了精巢的性别决定和分化。在实验中我们发现amh基因在性逆转后雄性的表达量高于性逆转前雌性上百倍，又在Amh下游目标基因cyp19a1a的启动子序列上发现了Smad结合位点。基于此，项目拟研究斜带石斑鱼Amh基因的结构和表达特性，研究其对斜带石斑鱼是否有性逆转作用，以及其参与的Amh-Smads-Cyp19a1a信号通路，从而对该基因的功能进行鉴定，阐释其在石斑鱼性逆转中的作用和调控机理。本项目的研究将为海水鱼类性转变生殖生理提供理论依据，深化性逆转现象的理解，并为将来的石斑鱼养殖育种提供科学指导。

斜带石斑鱼是一种雌雄同体且雌性先熟的鱼类，在发育过程中经历性逆转，因此是研究脊椎动物的性别决定和性别分化的理想模型。本项目成功的构建Amh在体过表达模型，并探索了在性别决定和性别分化过程中所起的功能，同时也初步研究了Amh对于在性逆转过程中相关的信号通路。取得研究成果如下：.1、通过定量PCR和免疫组化实验，发现Amh在斜带石斑鱼雄性大量表达。在亚成年斜带石斑鱼投喂 amh质粒实验，成功建立的在体过表达模型。实验结果表明，与对照组性腺相比，投喂组鱼性腺发生了结构的变化，即卵巢出现退化并伴随着精原细胞和精母细胞的出现。荧光定量也表明体内雄性相关基因的表达量显著升高，而雌性相关基因的表达量显著下降。同时激素测定发现，与对照组相比，amh质粒投喂组中，血清中的E2含量有了显著性下降，而11-KT含量却出现显著性升高。结果表明 amh在斜带石斑鱼性逆转过程中发挥的重要作用。.2、项目对性别分化时期斜带石斑鱼进行投喂amh质粒实验，发现Amh可以调节未分化的斜带石斑鱼出现雄性分化趋势。.3、项目对Amh在性逆转过程中相关的信号通路进行了研究。实验结果表明，利用细胞系表达纯化得到的斜带石斑鱼的Amh蛋白具有生物活性，并且可以激活下游Smad1/5磷酸化。双分子荧光互补实验证明，目标蛋白Smad5和下游Smad4可以进行互作。双荧光素酶实验发现Amh对cyp19a1a的启动子活性产生明显的抑制作用。同时发现，在cyp19a1a启动子上Smad特异性的结合区域主要是-2257/-2246bp和-1834/-1823bp位置。综上所述，可以初步证明在斜带石斑鱼中性逆转过程中存在Amh-Smads-cyp19a1a信号通路。