纳豆激酶高效分泌表达系统的构建与最适pH偏酸性改造

The heart and cerebrovascular disease caused by thrombus is one of the diseases with highest incidence and mortality rates. Researches on thrombolytic drugs and functional food with thrombolytic activity have developed very rapidly in recent decades. Nattokinase (NK) becomes one of the hot research topics due to its high thrombolytic effect. In our previous study, three signal peptides mediated NK expression in Bacillus subtilis were studied. In this project, we aim to enhance the production of recombinant NK and shift the optimum pH of NK towards acid pH, which are the bottleneck for application of NK at present. On one hand, we’ll construct a new system to achieve high-level secretory expression of NK in Bacillus subtilis by optimizing regulatory elements. On the other hand, based on the catalytic mechanism and crystal structure of NK, we are going to find out the key amino acids in NK for shfiting the optimum pH towards acid pH, and induce mutations by side-directed mutagenesis to achieve NK mutants with higher stablility in the acid enviorment. At last but not least, we’ll construct cost-effective engineering strains with high enzyme activity to promote the production and application of NK.

血栓导致的心脑血管疾病是当前危害人类健康、导致死亡率最高疾病之一，因此近年来溶栓药物及具有溶栓功能保健食品的研发进展得十分迅速。纳豆激酶具有高效溶血栓作用，是国内外科研热点之一。在前期研究中，我们研究比较了介导纳豆激酶在枯草芽孢杆菌中分泌表达的信号肽。在此基础上，针对目前纳豆激酶开发与应用中的分泌表达量低、酸性环境下稳定性差的问题，本项目拟进行以下两方面的研究：（1）通过启动子、信号肽等调控元件优化与匹配，构建新型分泌表达系统，实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达，为工业酶制剂的生产和应用提供理论基础和技术支持；（2）以纳豆激酶的催化机制和晶体结构为基础，结合生物信息学的分析与预测，寻找能够影响酶分子pH作用范围的关键氨基酸位点，通过分子改造来增强纳豆激酶在酸性环境中的稳定性，延长其在机体内的作用时间。

近年来溶栓药物及具有溶栓功能保健食品的研发进展得十分迅速，纳豆激酶具有高效溶血栓作用，是国内外科研热点之一。本项目的是针对目前纳豆激酶开发与应用中的分泌表达量低、稳定性差的问题，主要研究工作如下：.（1）对启动子进行筛选与改造，构建高效分泌表达纳豆激酶的系统，建立并优化枯草芽孢杆菌高密度发酵工艺，以满足更广泛和更高层次酶制剂的应用需求。通过对启动子的筛选、串联与改造，信号肽的筛选等研究工作，构建了高效分泌表达纳豆激酶的新型质粒，有效提升了纳豆激酶的表达量；建立并优化了枯草芽孢杆菌高密度发酵工艺，基因工程菌在5L发酵罐中发酵20 h趋于稳定，纳豆激酶活力达到820 FU/mL。.（2）以纳豆激酶的催化机制和晶体结构为基础，结合生物信息学的分析与预测，利用分子改造获得了具有较好耐酸性、耐热性纳豆激酶突变体，增强纳豆激酶的稳定性，延长其在机体内的作用时间。采用三种策略选取影响纳豆激酶分子稳定性的关键氨基酸位点，经过定点突变、叠加突变，获得了一系列性能优良的突变体：QN和QSN热稳定性大幅度提高；SY耐酸性大幅度提高；QYN酶活和耐酸性都有大幅度的提高。.项目按照要求顺利完成，获得了较好的学术成果。项目执行期间发表标注有本基金项目的论文共7篇，其中SCI文章6篇，EI论文1篇，申请发明专利3项，授权发明专利1项。培养博士研究生2人、硕士研究生2人。