井冈霉烯胺人工设计途径的适配与优化

Valienamine is the core functional moiety of acarbose and validamycin A, and serves as the important precursor for clinical antidiabetic agent voglibose. We took advantage of a heterogeneous aminotransferase with stereospecificity and designed a novel pathway for valienamine, which consists of 4 genes ValA, ValD, ValK and WecE in validamycin producer. However, the de novo pathway suffers from the low titer and yield for the low catalytic efficiency of the heterogeneous aminotransferase, WecE, and the interference of other endogenous substrates. Here, we plan to reconstruct the designed pathway and optimize its metabolic flux in engineered Streptomyces coelicolor by evoluting the catalytic efficiency of WecE through protein engineering methods, modulating adaptability of the pathway with multiple strategies including optimal promoters, CRISPR-Cas9 system and metabolomics analysis to get desired production of valienamine. This project will increase our capability to operate the artificial biological systems and broaden our knowledge for the newly-developing field of synthetic biology.

井冈霉烯胺是糖苷水解酶抑制剂的核心结构，其衍生物对糖尿病及相关疾病药物研发具有重要意义，因此其高效合成一直是化学及生物合成的关注点。我们前期应用合成生物学设计理念，以吸水链霉菌S5008井冈霉素合成途径为基础，引入异源氨基转移酶和敲除竞争基因，成功构建了由ValA、ValD、ValK和WecE等四个催化元件组成的井冈霉烯胺全新人工合成途径；然而，异源氨基转移酶催化效率低、宿主内源底物类似物干扰等系统适配性问题仍是合成生物学从设计走向应用所面临的瓶颈。本项目采用多元代谢调控策略，在转录和表达、酶催化效率、中间代谢物传递等层面系统探讨人工合成途径适配机制，以期优化关键限制节点氨基转移酶的催化效能，精细调控和平衡人工设计途径的代谢流，提升代谢通量，实现目标产物高效合成。本研究有望实现全新井冈霉烯胺设计合成途径的适配优化，为揭示和发展人工合成生物体系元件、模块组装等系统适配性机制和技术奠定基础。

井冈霉烯胺是假氨基糖类水解酶抑制剂的核心结构，在糖尿病及相关疾病治疗中具有重要作用，其高效合成一直是化学及生物合成的关注热点。我们前期应用合成生物学设计理念，通过偶联异源氨基转移酶与吸水链霉菌S5008中井冈霉烯酮前体供应途径，建立了井冈霉烯胺全新人工生物合成途径，为井冈霉烯胺制备提供了变革性的方案。然而，异源氨基转移酶催化效率低、宿主内源底物类似物干扰等系统适配性问题仍是合成生物学从设计走向应用所面临的瓶颈。本项目以井冈霉烯胺设计途径适配性提升为研究目标，采用多元代谢调控策略，发展设计反应导向的氨基转移酶进化技术，提升异源氨基转移酶WecE对设计底物井冈霉烯酮的催化活力，获得了系列催化井冈霉烯酮活力提升的优化突变体；以氨基转移酶WecE及其突变体在底盘细胞中的转录水平为指标，对不同来源的链霉菌启动子转录强度进行了适配优选，确定了保证优化突变体在底盘细胞内高水平表达的启动元件；采用优选启动子和优化突变体所构建的氨基转移酶过表达质粒与目标产物前体井冈霉烯酮的生物合成途径成功偶联，大幅提高了基因工程菌对目标产物井冈霉烯胺的合成能力。本研究综合利用蛋白质工程和代谢工程研究手段，采取消除代谢瓶颈和提升代谢通量的组合研究方案，为设计反应导向酶功能进化积累了成功经验，为人工合成途径从异源基因的简单复制和转移，到精细调控和定向适配提供了新思路。