麦冬皂苷通过下调lnc-MALAT1抑制NSCLC血管生成的机制研究

Angiogenesis is critical during the metastasis of NSCLC. “Nourish yin” therapy of traditional Chinese medicine is effective on inhibiting metastasis. Radix Ophiopogonis has significant effect of “nourish yin”, and ophiopogonin being the important active ingredient of it. Our previous study found that ophiopogonin inhibited tumor angiogenesis of A549 xenografts in nude mice and inhibited EphA2/Akt signaling pathway in NSCLC cell lines. Lnc-MALATA1is critical in regulating metastasis and migration of NSCLC, bioinformatics analysis found that transcription factor HIF-1α which locating downstream of EphA2/Akt pathway had several binding-site in the promoter region of lnc-MALATA1.Based on the preliminary research findings, this project is programmed to investigate the inhibition mechanism of ophiopogonin on angiogenesis in NSCLC. Phenotype of angiogenesis will be tested by chicken chorioallantoic membrane assay and matrigel plug assay. Regulation of HIF-1α on the transcription level of lnc-MALATA1 will be investigated by luciferase assay, EMSA and ChIP assay. It will be helpful for elucidating the molecular machanisms of ophiopogonin on the angiogenesis of NSCLC, and providing scientific basis for the use of “nourish yin” therapy in clinical treatment of NSCLC.

血管新生是NSCLC转移的关键环节，中医“养阴”疗法对于控制NSCLC转移具有显著的效果。麦冬是典型的养阴类中药，而麦冬皂苷是其重要的活性成分。前期研究表明，麦冬皂苷能显著抑制A549移植瘤裸鼠肿瘤血管生成，并抑制其EphA2/Akt信号通路。lnc-MALAT1是与NSCLC侵袭转移密切相关的长链RNA，生物信息学分析发现其启动子区存在多个EphA2/Akt通路下游转录因子HIF-1的结合位点。基于以上研究发现，本项目拟通过CAM接种实验和matrigel plug assay研究麦冬皂苷抑制NSCLC血管生成的表型；通过luciferase assay、EMSA和ChIP等实验，确定麦冬皂苷通过HIF-1调控lnc-MALAT1转录水平，进一步影响NSCLC血管生成的作用，以初步阐明麦冬皂苷抗NSCLC的分子机制，并为“养阴”疗法用于临床抑制NSCLC转移提供一定的科学依据。

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌的主要类型，临床治疗失败的原因主要是复发和发生重要器官的转移，约80-90%的患者因转移而死亡。中医“养阴”疗法对于控制NSCLC转移具有显著的效果。麦冬是典型的养阴类中药，而皂苷是其主要的活性成分。前期研究表明，麦冬皂苷B（Ophipogonin B，OP-B）具有显著抑制NSCLC细胞株增殖及转移的作用。为此，首先进行了OP-B对A549细胞株基因表达调控的数字基因表达谱（Diginal gene expression,DGE）测序，结果显示A549细胞中上皮间质转化途径（epithelial mesenchymal transition, EMT）为受OP-B调控的Top1信号通路，western blot法验证了测序结果，发现10μM浓度的 OP-B显著上调ZO-1、Ecadherin的表达，同时抑制Snail、Slug等蛋白的表达。近年来，诸多研究表明长链非编码RNA（long non-coding RNA, lincRNA）和肿瘤的进展具有密切关联，测序结果同时发现OP-B能显著调控A549中linc00668的水平（给药前后其表达水平差异倍数为6.672），RT-PCR结果验证了该测序结果。为造成炎症微环境，将THP-1经LPS诱导后与A549细胞共培养，结果linc00668呈显著高表达，同时EMT呈上升趋势，而OP-B给药后显著抑制linc00668的同时逆转EMT信号途径。生物信息学预测及双荧光素酶报告基因（luciferase assay）结果证明linc00668通过与miR-473-5p结合继而调控EMT信号通路。另外，对EA.hy926细胞的微管形成实验表明，OP-B（10μM）显著抑制体外微管形成，同时对血管生成相关蛋白VEGFR2、Tie-2，EphA2的蛋白表达及AKT（S473）、PLC（S1248）、EphA2（S897）的磷酸化水平具有显著抑制作用。体内基质胶包埋实验（Matrigel plug assay）实验结果表明，OP-B显著抑制A549移植瘤的体内转移和血管生成。该研究结果初步阐明了麦冬皂苷OP-B对 NSCLC细胞转移及血管生成的抑制作用及机制，为中药临床应用提供了重要的理论依据。