砷暴露对lncRNA PANDA基因表达的影响及其机制研究

LncRNA is an important functional molecule associated with many diseases. PANDA gene which belongs to lncRNAs is expressed at very high level in human exposure to arsenic trioxide. Furthermore, PANDA gene is related to secondary methylation index apparently. It is estimated that there were many possible methylation area in promoter of PANDA by the bioimformatics software. methylation area of PANDA may influence gene expression, by which arsenic trioxide improves the PANDA expression. In this project, the promoter DNA methylation level of PANDA and PANDA in the arsenic trioxide exposure population and control will be detectived in order to find if arsenic trioxide affects the expression of PANDA by changing methylation . Through arsenic trioxide exposing cells, changes of promoter DNA methylation level of PANDA and PANDA of cells under arsenic trioxide exposure will be observed to prove the influences to promoter DNA methylation level of PANDA and PANDA by arsenic trioxide. Finally, the expression change of PANDA under arsenic trioxide exposure will be observed to prove that arsenic trioxide influences the expression of PANDA through methylation

LincRNA是一类起重要功能且与疾病密切相关的分子。申请人发现lncRNAs中的PANDA基因在职业三氧化二砷暴露人群中表达显著增高，且与二甲基化指数显著相关。生物信息学软件预测PANDA启动区存在多个可能的甲基化区域，在结合文献的基础上提出：PANDA启动区甲基化区域，将影响基因表达，砷通过这两种机制影响PANDA表达。本研究首先检测职业三氧化二砷暴露人群和对照人群外周血淋巴细胞中PANDA基因启动区DNA甲基化水平和PANDA的表达量，初步探索三氧化二砷暴露下甲基化改变对PANDA表达影响。然后通过三氧化二砷染毒细胞比较染毒前后启动区甲基化水平和PANDA变化证明砷对二者的影响。最后利用干扰细胞中甲基化变化表达，观察三氧化二砷染毒后细胞中PANDA的变化，证明三氧化二砷通过甲基化影响PANDA的表达。

无机砷是一种常见的环境与职业污染物，无机砷暴露会引起肺癌，乳腺癌等多种癌症，最近研究表明砷暴露还可导致高血压、糖尿病等疾病发病率增加。PANDAR基因转录产物为非编码RNA，在多种癌症中表达异常，并与细胞损伤后的凋亡、周期抑制相关。研究表明p53蛋白表达和DNA损伤反应可诱导该基因表达增加，该RNA通过与转录因子结合，调控NOXA。PUMA等凋亡相关基因表达，从而调控凋亡。研究表明接触无机砷可引起甲基化供体的减少以及氧化应激，进一步致使基因表达改变以及DNA的损伤。本课题组前期研究表明，砷暴露引起了PANDAR基因表达显著升高，生物信息学软件预测PANDAR启动区存在多个可能的甲基化区域，在结合文献的基础上提出：PANDAR启动区甲基化区域，将影响基因表达，砷通过这甲基化机制影响PANDAR表达。本课题检测工人尿中无机砷、一甲基胂酸（MMA）、二甲基胂酸（DMA），并采用实时荧光定量PCR（qPCR）的方法检测基因表达水平和DNA损伤程度，用甲基化特异的高分辨率熔融曲线（HRM）测定DNA甲基化程度。研究的结果表明砷暴露会导致砷冶炼厂工人的外周血淋巴细胞中PANDAR表达和DNA损伤的增加，但是并未影响PANDAR基因启动区DNA的甲基化。进一步线性相关分析发现PANDAR表达、DNA损伤与工人尿中无机砷、MMA、DMA以及MMA百分比呈正相关，与DMA百分比呈负相关，表明无机砷代谢增加可以减轻基因表达的变化和DNA的损伤。通过分层统计显示了尿中一级甲基化指数（PMI）低的工人其外周血淋巴细胞中DNA损伤和甲基化水平增加，尿中二次甲基化指数（SMI）低的工人其外周血淋巴细胞中PANDAR表达水平和DNA损伤水平增加，结果表明无机砷的代谢与DNA甲基化和损伤相关。工人外周血淋巴细胞中PANDAR基因启动区的DNA甲基化程度与该基因表达成负相关，说明PANDAR基因可以受到与甲基化相关的机制调控。以上发现提示了砷冶炼厂工人砷致癌的潜在机制可能与DNA甲基化、PANADR表达和DNA损伤改变有关，为砷暴露生物标志物寻找提供了线索。