microRNA-181a在调控缺氧缺血诱导的血管内皮细胞损伤中的作用及机制研究

The results of our previous study have indicated that, under hypoxic conditions, the expression of miR-181a in vascular endothelial cells was downregulated, while Malat1 was upregulated, and over-expression of miR-181a could reduce the release of ROS in endothelial cells and alleviate the damage caused by oxidative stress. On this basis, we intend to establish endothelial cell and mouse ischemic model for over-expressing or inhibiting miR-181a, regulate the expression of Malat1 and HMGB2, use PCR, Western blot, flow cytometry, vector construction, transfection experiment, and other molecular biological methods, combine with biological information analysis methods, to clarify the relationship among miR-181a, Malat1 and HMGB2 from the cellular level, protein level and molecular level , and to test the changes of ROS level and endothelial cell function, attempting to further confirm the effect of miR-181a on vascular endothelial cells from the upper and lower stream. We aimed to identify the important role of miR-181a in ischemic cerebrovascular disease, hoping to provide new ideas and strong theoretical support for the treatment of ischemic cerebrovascular diseases through intervention of miRNA expression in the future.

本课题组前期研究已发现，在缺氧条件下血管内皮细胞的miR-181a表达下调，而Malat1表达上调；且过表达miR-181a可使内皮细胞内ROS释放量降低，减轻氧化应激带来的损伤。在此研究基础上，我们拟建立过表达或抑制miRNA-181a的内皮细胞及小鼠缺血模型，调控Malat1、HMGB2的表达，利用PCR、Western blot、流式细胞仪检测、载体构建、转染实验等分子生物学方法，并结合生物学信息分析方法，从细胞水平、蛋白水平、分子水平阐明miR-181a、Malat1、HMGB2三者之间的关系，并了解细胞内ROS水平及内皮细胞功能变化，试图从上下游进一步证实miR-181a对血管内皮细胞的影响，明确miR-181a在缺血性脑血管疾病中的重要作用，希望为今后通过干预miRNA表达来治疗缺血性脑血管疾病提供新思路和有力的理论支持。

miR-181a是miR-181家族中表达最高的成员，其在脑血管疾病中发挥着重要作用。生物信息学发现，Malat1是miR-181a的一个竞争性内源RNA，而HMGB2是其下游作用靶点。在本课题中，我们建立了细胞miR-181a过表达/抑制载体（miR-181a-mimics及anti-miR-181a）、细胞Malat1沉默载体（shRNA-Malat1）及miR-181a过表达载体小鼠模型，并在细胞实验上研究miR-181a、Malat1对糖氧剥夺诱导的血管内皮细胞的HMGB2表达、细胞氧化应激、细胞凋亡及炎症因子等的影响，且在动物实验上探讨miR-181a对缺氧缺血下小鼠Malat1、HMGB2表达、氧化应激损伤的影响等。 .我们的研究结果发现在缺氧缺血情况下，过表达miR-181a对内皮细胞有保护作用。通过细胞增殖测定、PCR、流式细胞术、蛋白免疫印迹等方法，我们发现miR-181a过表达会导致Malat1和HMGB2表达水平下降，减少缺氧诱导的ROS的释放、细胞死亡和细胞凋亡。这些结果表明，通过 Malat1/miR-181a/HMGB2信号通路调控缺氧所致血管内皮细胞的损伤。.在此基础上，我们发现在缺氧的条件下血管内皮细胞中也会出现其他micro-RNA水平变化，其中miR-152-3p的变化较为明显。我们的研究发现在缺氧条件下血管内皮细胞中miR-152-3p的表达水平会升高。而抑制miR-152-3p可以提高血管内皮细胞活力及增加血管生成，会减轻缺氧诱导的内皮细胞通透性。此外DDX6可作为miR-152-3p的靶点，且受miR-152-3p2负性调控。. 以上研究发现为今后通过干预 micro-RNA表达来治疗缺血性脑血管疾病提供了新的思路和理论支持。