应用NEDDYLATOR技术研究IAP的蛋白质相互作用组及其在细胞死亡过程中的调节功能

The study of programmed cell death (PCD) has been focused on Apoptosis for a long time while there is an emerging role for non-apoptotic programmed cell death in drug treated cancer cells. However, the molecular mechanism of other types of PCD, such as necroptosis and autophagic cell death are not thoroughly understood, and the divergent nodes in cell death signaling pathway that dictate the different modes of cell death are not fully identified yet. .Here we plan to study the role of Inhibitor of Apoptosis Proteins (IAPs) in different types of cell death. IAPs are ubiquitin ligases that target classic pro-apoptotic proteins for degradation. They also have pro-survival functions in both necroptosis and autophagic cell death. IAPs exert their function via protein-protein interactions with either substrates or regulators. The identification of IAP interacting proteins are typically difficult because of the weak interaction between IAP and the binding protein and the rapid degradation of ubiquitinated target. Here we propose to combine NEDDylator catalytic tagging system with mass spectrometry to identify IAP interacting proteins in each cell death mode. The systematic and unbiased characterization of IAP interactome will potentially reveal the critical nodes in different types of cell death. We will further validate and characterize the interplay between IAP and the interacting proteins to disclose the molecular mechanism for cell death regulation.

长期以来对细胞程序性死亡的研究都集中在细胞凋亡。其它类型的细胞程序性死亡，如程序性坏死和自噬死亡等，也越来越受到关注。然而，我们对于各种细胞死亡方式的原理及决定细胞不同死亡方式的节点了解并不全面。本项目将研究凋亡抑制蛋白IAP家族在不同细胞死亡形式中的作用。我们将结合NEDDylator催化标记和蛋白质谱，系统全面地研究IAP的蛋白质相互作用组。通过对不同细胞死亡形式下IAP结合蛋白异同的研究，确定IAP信号通路中和细胞死亡方式特异相关的节点。最后，我们将进一步验证研究在不同的细胞死亡信号通路中，IAP是如何调控或受控于它的相互作用蛋白。我们的研究将有助于了解细胞凋亡，程序性坏死和自噬死亡的分子机制。

在细胞的程序化死亡过程中，存在各种各样的蛋白质-蛋白质间相互作用。那些具有重要生理功能的蛋白质间互作，如凋亡抑制蛋白泛素连接酶IAP家族与其底物之间的相互作用是瞬时和微弱的。因此，解析其在不同细胞死亡程序中的不同相互组用蛋白有利于阐明其功能机制。本课题立足于对凋亡抑制蛋白IAP家族的蛋白质相互作用组研究，尝试鉴定与IAP瞬时和微弱地相互作用的蛋白质。此研究的关键点是找到合适的用来鉴定微弱蛋白质相互作用的方法。为此，我们开发了新型邻近标记技术，通过将IAP蛋白与原核蛋白PafA融合表达来实现对IAP相互作用蛋白的生物素化标记。该方法和已有其它邻近标记方法相比，标记效率更高，毒性更小。我们通过此方法结合高精度质谱分析，分别鉴定了细胞凋亡过程中、细胞程序性坏死和自噬过程中，XIAP和cIAP1的蛋白质相互作用组。我们的结果表明XIAP和cIAP1虽然有不同的相互作用蛋白组，但也存在这两个蛋白之间的相互作用。借由此课题开发的邻近标记技术有着广泛的应用场景，将有利于各种蛋白质-蛋白质相互作用的研究。