基于Nrf2/ARE通路探讨涤痰开窍法对阿尔茨海默病模型的作用机制

There are still no effective treatments to prevent, halt, or reverse Alzheimer's disease. The aim of our present study is to determine the protective mechanism of Ditan Decoction, which could eliminating phlegm for resuscitation, in the model of Alzheimer’s disease. Our previous study showed that Ditan Decoction could activate the PI3K/Akt signaling pathway, which could induce Nrf2 nuclear translocation. And Nrf2 is a pivotal transcription factor in the defense against oxidative stress. In this project, we are going to investigate the anti-inflammation and anti-oxidation effects of Ditan Decoction on Nrf2/ARE signal pathway in vivo and in vitro. We speculate that Ditan Decoction could reduce oxidative stress and inflammation reaction, thus inhibit the production of Aβ. The mechanism is related to up-regulating the PI3K/Akt signaling pathway, and then activating the Nrf2, which can translocate to the nucleus to combine ARE, resulting in a coordinated activation of gene expression. The methods of EMSA, RNA interference are going to be used. Our study will provide important mechanistic insight into the potential use of eliminating phlegm for resuscitation method as therapeutics to oppose neurodegenerative disease.

阿尔茨海默病（AD）又称老年性痴呆，目前缺乏有效的治疗措施。历代多位医家认为：痰浊阻窍是老年性痴呆发生的重要病机，对痰的治疗是对痴呆治疗的关键。因此本项目拟研究涤痰开窍法的代表名方涤痰汤治疗AD的作用机理。申请者的前期研究发现：涤痰汤能激活PI3K/Akt信号通路。而PI3K/Akt可以激活抗氧化防御系统的关键调节蛋白Nrf2。在此基础上，本项目拟观察涤痰汤对AD模型的抗炎、抗氧化作用，重点探讨Nrf2/ARE通路在其中的作用，验证假设：涤痰汤通过激活PI3K/Akt，使Nrf2磷酸化后与Keap1解偶联而激活，进而进入细胞核内结合抗氧反应元件（ARE），启动下游分子的转录和表达，减轻氧化应激和炎症反应，从而抑制Aβ的生成。本项目拟采用RNA干扰等技术，在体内（APP/PS1转基因小鼠）及体外（原代海马神经元和N2a/APP695细胞）进行研究，其结果将为涤痰开窍法的临床应用提供实验依据。

阿尔茨海默病( Alzheimer's disease，AD) 是一种不可逆的进行性神经退行性疾病，是痴呆和认知障碍的主要原因。其临床表现为进行性的记忆障碍、智力减退以及行为与人格的改变，严重者丧失生活自理能力以致于死亡。AD重要的神经病理学改变是包含β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ) 的老年斑在细胞外积聚和神经原纤维缠结。目前，AD的病因学和发病机制尚不清楚，也没有有效的治疗或逆转该疾病进展的药物及方法。中国中医药在数千年发展过程中，积累了丰富的经验，特别是在延缓衰老、改善由于增龄而引起的人体各系统和器官的退行性变化方面，形成了独特的理论和有效的防治方法。AD 属于中医学“呆病”范畴，痰浊阻窍为痴呆的主要证型。经典的中药复方涤痰汤出自《奇效良方》，具有化痰开窍之功效，由半夏、茯苓、姜南星、橘红、枳实、竹茹、人参、石菖蒲、甘草9味中药组成。本项目研究内容为在APP/PS1双转基因AD模型小鼠和N2a/APP695细胞中，观察涤痰汤对Aβ生成的影响并探索其作用机制，验证涤痰汤是否通过激活Nrf2/ARE通路，发挥抗氧化的作用，进而减少Aβ的生成。本研究发现：涤痰汤通过使Nrf2与Keap1解偶联而激活，进而Nrf2进入细胞核内启动下游分子NQO1、HO-1的转录和表达，使SOD活性增高、MDA水平降低，减轻了氧化应激，从而抑制Aβ1-40和Aβ1-42的生成，进而可以减轻AD转基因模型小鼠学习记忆障碍。此外，本研究还发现：涤痰汤拆方亦能使AD模型鼠海马的神经原纤维缠结减轻，APP蛋白Thr668位点的磷酸化水平下调，海马Aβ1-42的生成减少，激活PP2A、抑制GSK-3β，减轻tau蛋白的过度磷酸化，从而改善AD模型大鼠的空间学习记忆障碍。本研究结果为涤痰汤广泛的临床应用提供了实验理论依据。