养阴清肺活血法调控AMPK介导自噬在放射性肺损伤的机制研究

The mechanism of radiation-induced lung injury (RILI) is complex. According to cytokine cascade theory,the most widely accepted mechanism recently, oxidative stress induced by ionizing radiation is the initiating factor for subsequent cascade effect, caused by the formation of inflammatory micro-environment and the immune imbalance. Oxidative stress damage can induce the change of the autophagy activity. Whereas, autophagy, as a protective mechanism, can reduce oxidative damage and promote cell survival.Therefore,there is a certain relevance between RILI and autophagy. AMPK, an ubiquitous serine / threonine protein kinase in organism, could be activated directly or indirectly and then induce autophagy. The activation of AMPK can inhibit TNF-α, IL-1 β, IL-6 expression through direct and indirect activation induced autophagy. Early studies have confirmed that "Yangyinqingfeihuoxue" therapy in Chinese medicine could effectively reduce the degree of radioactive pneumonia lung tissue inflammation and the expression and release of TGF -β, IL-6, TNF-α.In this study, we will discuss the mechanism of autophagy induced by AMPK activation through observing the local oxidative damage and autophagy in lung parenchymal cells and lung tissue in vivo after radiation. By using "Yangyinqingfeihuoxue" therapy, initially discuss the role of autophagy induced by AMPK in RILI and provide new theoretical basis for the development and application of new Chinese medicine.

放射性肺损伤(RILI)发生机制比较复杂,目前最为公认“细胞因子级联”学说，其中电离辐射引起的氧化应激是炎症微环境形成、免疫失衡引起后续级联效应的始动因素。氧化应激损伤引起自噬活性的改变，自噬作为一种保护机制，能减轻氧化损伤、促进细胞生存，因此RILI与自噬存在一定的相关性。AMPK是生物体内普遍存在的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过直接和间接方式激活诱导自噬，AMPK的激活可以抑制TNF-α、IL-1β、IL-6的表达。前期研究证实中药“养阴清肺活血”法治疗 RILI 可有效减轻放射性肺炎肺组织炎症程度，降低TGF-β、IL-6、TNF-α的表达与释放。所以本课题通过研究体外肺实质细胞以及体内肺组织在辐射后局部存在氧化损伤和自噬现象，探讨AMPK介导自噬的发生机制；通过“养阴清肺活血法”干预,初步探讨其通过AMPK调控自噬在RILI的作用，为中药新药开发应用提供新的理论依据。

研究背景：放射性肺损伤(RILI)发生机制比较复杂,电离辐射引起的氧化应激是炎症微环境形成、免疫失衡引起后续级联效应的始动因素。氧化应激损伤引起自噬活性的改变，自噬作为一种保护机制，能减轻氧化损伤、促进细胞生存，因此RILI与自噬存在一定的相关性。AMPK通路可以通过直接和间接方式激活诱导自噬，前期研究证实中药“养阴清肺活血”法治疗 RILI 可有效减轻放射性肺炎肺组织炎症程度，降低炎性因子的表达与释放。所以本课题通过研究体外肺实质细胞以及体内肺组织在辐射后局部存在氧化损伤和自噬现象，探讨AMPK介导自噬的发生机制；通过“养阴清肺活血法”干预,初步探讨其通过AMPK调控自噬在RILI的作用。.研究内容：1 建立大鼠肺泡巨噬细胞放射性肺炎模型：①检测细胞DNA氧化损伤指标8-OHDG、脂质损伤指标MDA；②电镜观察细胞内自噬小体的形成；③Western-Blot检测LC3II 与LC3 I 比值、p62蛋白；④运用Western-Blot 检测AMPK、mTOR、ULK1/2 表达，验证AMPK 与mTOR，AMPK 与ULK1/2 两者的相关性；⑤运用RT-qPCR 检测LKB1 基因的表达，Western-Blot 检测LKB1、AMPK 蛋白表达，验证其相关性。2 建立大鼠放射性肺损伤模型：实验内容同体外。.研究结果：1 体外、体内实验均证明了放射线均可以诱导大鼠产生氧化损伤，进而导致放射性肺炎的发生 2 电镜扫描均观察到了自噬小体的形成 3 放射线可以降低大鼠细胞内的自噬程度，降低LKB1基因的表达 4 中药养阴清肺活血方可以减轻氧化损伤反应、通过激活LKB1基因，激活AMPK通路，进而抑制m-TOR、激活ULK1的双通路激活自噬，从而减轻放射性肺炎的程度。本课题研究结果对于临床新药的研发及科学防治放射性肺炎提供了一定的思路。