基于全线粒体基因组测序技术研究线粒体单倍型对缺血性脑卒中遗传易感性的影响

At present, most genetic susceptibility studies have focused on the nuclear genome and have not made a breakthough. Mitochondrion plays a central role in metabolism and biological energy conversion. Mitochondrial haplotypes which gathered in a specific environment could affect the function of mitochondria and lead to the susceptibility of diseases. Our preliminary results showed that mitochondrial haplotype D4b was significantly associated with ischemic stroke (IS) in Chinese Han population（P=0.00002，OR = 0.028, 95% CI = 0.002～0.468）. We therefore hypothesized that mitochondrial DNA haplogroups affect the assembly and stability of the mitochondrial respiratory chain, which is potentially related to susceptibility to IS. The purpose of this project is to explore whether mtDNA haplotypes are involved in the etiology of IS. We recruit 100 IS patients and 100 matched controls to do a genome-wide association study of mitochondrial DNA. For the positive associated mtSNPs and haplotypes, we will verify them in a larger population (cases and controls, n=500,respectively) and test the ATP content, ROS levels and membrane potential of mitochondria with the trans-mitochondrial cybrids. Screening of susceptible mtSNPs and haplotypes could be used as genetic markers for predicting the risk of IS. This study will reveal the mechanism and characteristics of genetic susceptibility of IS from the perspective of nuclear genetic inheritance, and provide theoretical basis for the diagnosis, treatment and prevention of IS.

目前缺血性脑卒中（IS）遗传易感机制的研究多集中在核基因组且未取得突破性进展。线粒体处于新陈代谢和生物能量转换的中心地位，其在特定环境富集的单倍型能够影响线粒体的功能，导致人体对某些疾病产生易感性。我们的前期研究结果表明，线粒体单倍型D4b与IS存在显著的阳性关联（P=0.00002）。由此提出假说：特定的线粒体单倍型可改变线粒体呼吸链的功能与稳定性，进而影响个体对IS的遗传易感性。因此，本课题拟选取病例-对照各100例，进行IS全线粒体基因组关联分析，对筛选出阳性关联的mtSNPs及单倍型扩大样本（病例-对照各500例）进行验证；并采用转线粒体细胞模型检测线粒体的ATP含量、ROS水平以及膜电位高低等功能指标。筛选出易感的mtSNPs及单倍型可作为预测IS发病风险的遗传标志物。本研究从核外遗传的角度揭示IS的遗传易感机制及其特点，将为IS的诊断、治疗及人群防治提供理论依据。

缺血性脑卒中（IS）发生时，线粒体平衡机制被打破，相关信号通路被激活，最终导致神经细胞级联性损伤及中枢神经系统功能异常。本项目旨在探究线粒体基因变异及氧化应激与IS的相关性，筛选出我国汉族人群IS的易感标志物，揭示mtDNA拷贝数变异影响线粒体呼吸链的功能参与IS的病理机制。.方法:1.采用高通量测序的方法对52例IS患者和55例健康对照的mtDNA进行全线粒体基因组测序与分析；2.采用SNaPshot技术，对200例IS患者和200例正常对照进行扩大样本验证；3.采用试剂盒检测101例IS患者和101例正常对照的MDA、SOD、H2O2、CAT等氧化应激指标；4.构建mtDNA拷贝数变异细胞模型，探究mtDNA拷贝数变异对线粒体膜电位及呼吸链复合物功能的影响。.结果:1.首次发现9个未报道的mtDNA变异位点；共发现30个线粒体单倍型类群，其中D4单倍型是最常见的单倍型，其次是F1、D5以及M7、G2、F2。筛选出15个可能与IS发病相关的mtDNA位点用于扩大样本验证；2.m.T195C与m.T12338C位点的频率在IS组与对照组；m.T195C、m.C311T、m.C16355T位点的频率在LAA亚型与对照组之间具有统计学差异，P＜0.05。3.CAT和H2O2的水平在IS组与对照组之间存在统计学差异（P＜0.05）。4.TFAM敲低后，线粒体呼吸链复合体I、II活性、线粒体膜电位以及ATP生成水平显著降低（P＜0.05）；转染过表达型TFAM质粒（OE-TFAM）后，三项指标均显著升高（P＜0.05）。.结论：1.本研究揭示河南地区汉族人群mtDNA单核苷酸多态性特征与单倍型的分布特点，丰富了人类mtDNA数据库。2.筛选出基于我国汉族人群的IS易感标志物，m.T195C和m.T12338C是IS发生的保护因素；m.T195C和m.C311T是LAA亚型发生的保护因素，m.C16355A是LAA亚型发生的危险因素。3.阐明非传统危险因素氧化应激与IS的相关性，H2O2的水平升高、CAT水平降低是IS发生的独立危险因素。4.mtDNA拷贝数下降，导致线粒体呼吸链复合体活性下降、膜电位降低以及ATP生成减少，引起线粒体的功能障碍，进而影响神经细胞的代谢和功能，参与IS的病理损伤。