猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白活性位点鉴定与抗病毒感染机制

Transmissible gastroenteritis virus (TGEV) leads to severe diarrhea and high mortality. TGEV spike (S) protein is a major immunogen. Development of S protein-based small molecules and vaccines are important for prevention of TGEV infection. In this study, we will express and purify TGEV S protein and generate its monoclonal antibody (mAb) by immunizing BALB/c mouse. Using this mAb as target, its ligands will be identified by phage display technology. Sequences of these ligands will be determined following DNA extraction and PCR to identify active sites in S protein. By bioinformatics, virological assays, immunofluorescences and real-time PCR, the peptides encooding these sites, which have neutralizing and inhibition ability of cell infection to TGEV , will be determined. Antiviral activity of these active sites to TGEV in vivo will be investigated by immunizing piglets. In addition, we will use phages containing these active sites to develop differentiation ELISA. This study will provide basis for understanding mechanisms of TGEV entry and developing anti-TGEV agents.

猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）可致仔猪重症腹泻和死亡，其纤突蛋白S为主要免疫保护性抗原。开发S蛋白基础的小分子药物和疫苗对防治TGEV感染有重要意义。本研究拟高效表达和纯化TGEV S蛋白，免疫BALB/c鼠，制备TGEV S蛋白单克隆抗体。以纯化单抗为靶蛋白，噬菌体肽库展示技术淘选与TGEV S蛋白单抗结合噬菌体。噬菌体DNA提取、PCR扩增和测序确定TGEV S蛋白上的活性位点。序列比对和病毒中和实验鉴定这些位点是否为中和表位。合成编码活性位点肽，病毒蚀斑法、免疫荧光和Real-time PCR研究其抑制TGEV感染效果。免疫实验仔猪分析S蛋白活性位点体内抗TGEV感染作用。另外，含S蛋白活性位点的噬菌体建立肽介导ELISA诊断方法。该研究将为TGEV侵入细胞机制和抗TGEV小分子药物开发提供理论基础。

猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis, TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV）引起的以腹泻、呕吐、脱水等为主要症状的高度接触性传染病。该病感染仔猪死亡率可达到100%，给养猪业带来巨大的经济损失。TGEV纤突蛋白S为主要免疫保护性抗原，开发S蛋白基础的小分子药物和疫苗对防治TGEV 感染有重要意义。本研究将TGEV带有A、B、C、D四个抗原位点的S基因克隆到真核表达载体pVAX中，构建的重组真核表达质粒pVAX-TGEV-S免疫BALB/c小鼠，利用常规单克隆抗体技术获得两株杂交瘤细胞（1H4和4E9）。间接免疫荧光检测表明两株单抗均能与TGEV的细胞培养物反应而呈现特异性绿色荧光，Western Blot分析表明1H4单抗可以识别TGEV全病毒S蛋白的线性表位。病毒蚀斑实验证明单抗1H4株具有较好的中和病毒活性且呈现剂量依赖性。两株单抗均与TGEV有特异性反应，而与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、流行性腹泻病毒（PEDV）等病毒不存在交叉反应，说明获得的单抗有良好的特异性。利用制备的单抗建立了检测TGEV间接竞争ELISA方法，该检测方法与PEDV和猪轮状病毒（PRV）无交叉反应，是一种更简单快速灵敏的TGEV检测方法。.以纯化的1H4腹水单抗作为靶分子，按照随机噬菌体十二肽库展示技术进行4轮筛选，获得28个具有高亲和力的噬菌体克隆。经ELISA实验筛选出10个与TGEV S蛋白单克隆抗体特异性结合最强的噬菌体单克隆进行测序，获得含有5个不同的多肽序列，将与病毒反应性最高的7号噬菌体（SGVYKVAYDWQH, P-S）和25号噬菌体（YTSSMLISSSLS, P-Y）合成多肽，评价其抗病毒能力。实时荧光定量RT-PCR实验证实亲和多肽P-S和P-Y对TGEV感染有较好的抑制效果且呈剂量依赖性，其中P-Y亲和多肽的抑制效果更好。2周龄仔猪免疫攻毒试验表明P-Y亲和噬菌体免疫仔猪能诱导较好的免疫反应，与疫苗免疫组无统计学差异，都能保护仔猪TGEV的攻击而不表现临床症状。