氧化葡糖杆菌GOX1857脱氢酶区域选择性催化半乳糖醇第3位羟基的分子机制及酶分子改造

Gluconobacter oxydans is one of the most important organisms in industry biotechnology because of its ability to incompletely oxidize various sugars, sugar alcohols and sugar acids, in which those reactions are catalyzed by PQQ-dependent membrane-bound dehydrogenases linked to the respiratory chain. Those PQQ-dependent membrane-bound catalyses the regioselective oxidation of substrates according to the Bertrand-Hudson rule, which states that polyols with a cis arrangement of two secondary hydroxyl groups in D-configuration to the primary alcohol group (D-erythro configuration) are oxidized to the corresponding ketoses. Those polyols without D-erythro configuration can not be oxidized. D-galactitol does not have the D-erythro configuration, and theoretically can not be oxidized by those PQQ-dependent membrane-bound dehydrogenases. Interestingly, we found that G.oxydans can regioselectively oxidize D-galactitol to never reported product 3-ketose D-lyxo-3-hexulose, instead of 2-ketose. Our preliminary studies showed the enzyme regioselectively oxidized D-galactitol to 3-ketose is a kind of PQQ-dependent menbrane-bound dehydrogenase, which does not meet the Bertrand-Hudson rule. Based on such unique reaction, we intend to solve the following key scientific questions: One is to identify the enzyme which biocatalyze the unique reaction and its kenetic constants; the second is to clarify the catalytic mechanism, which could propose a new reaction mechanism of regioselective oxidation of polyols, as well as the addition of new family of PQQ-dependent membrane-bound polyol dehydrogenase, and open the new pathway to biosynthesize 3-ketose.

氧化葡糖杆菌具有丰富的PQQ依赖的膜结合的脱氢酶，能区域专一性的将多元醇的第2位或倒数第2位羟基脱氢氧化，生成相应的2-酮糖（2-ketoses）。只有具备Bertrand-Hudson法则构型的多元醇底物才能被膜结合的脱氢酶催化。而D-半乳糖醇不具有Bertrand-Hudson法则的构型，理论上不能被氧化葡糖杆菌膜结合的脱氢酶脱氢氧化。然而我们的研究发现，该菌不但能催化D-半乳糖醇，而且是区域专一性的将第3位羟基氧化，生成一种新的3位酮糖（3-ketose），并证实该酶是PQQ依赖的与膜结合的GOX1857脱氢酶。本项目拟在此基础上结合生物化学和结构生物学的研究手段深入研究该酶区域专一性地催化半乳糖醇第3位羟基脱氢氧化的分子机理，进而对该酶进行理性设计改造，拓展它的底物范围，来制备其它稀有3-ketoses及其衍生物，为化学药物（如糖苷类药物）的合成提供稀有糖基供体。

项目背景：.氧化葡萄糖杆菌（Gluconobacter oxydans, G. oxydans）的细胞质外膜周质空间含有许多膜结合脱氢酶，可以将多元醇类化合物（糖类或糖醇类）不完全氧化生成相应的醛糖、酮糖或糖酸，在生物医药合成领域具有广泛应用。本文在以半乳糖醇作为底物，利用氧化葡萄糖杆菌G. oxydans 621H制备D-塔格糖时，意外发现一种产物为特殊酮糖。本研究从此化合物出发，对该菌株中氧化半乳糖醇的特殊氧化反应进行了系统性的挖掘和研究，旨在拓展羰基化反应类型。.研究内容：.1. 氧化葡萄糖杆菌膜结合脱氢酶区域选择性催化半乳糖醇的特殊反应。.本研究发现了不具备Bertrand-Hudson法则底物特点的半乳糖醇，却能被G. oxydans中PQQ依赖性膜结合脱氢酶氧化，并且其氧化底物的羟基位置为第5位和第3位，分别生成D-塔格糖和来苏糖基-3-己酮糖两种产物，揭示了Bertrand-Hudson法则的一个特例。..2. 氧化半乳糖醇的脱氢酶的鉴定与功能研究。.通过荧光细胞定位、酵母细胞表面展示以及大亚基催化产物检测等实验，确定了小亚基SldB具有牵引与之融合的蛋白至细胞质膜的锚定功能，大亚基SldA具有催化活性中心与底物结合中心，并且大小亚基的互作与结合是完成催化反应的必需条件。.3. SLDH脱氢酶的催化机制及大小亚基相互作用的研究。.本研究利用AlphaFold2机器学习的方法，并结合结构生物学和计算生物学等手段对该蛋白进行了结构预测和机制研究。通过AlphaFold2蛋白结构预测、分子对接、分子动力学体系稳定性分析、结合自由能分析、丙氨酸突变扫描以及生物学实验验证，最终预测认为SLDH糖醇催化的活性口袋是由Leu415、Asp416、Gly417、Lys556、Asp528、Asp530、Tyr652、Gly483、Asn484以及Trp466氨基酸残基组成。通过分子动力学模拟实验预测大小亚基的结合主要是由大亚基的Arg630、Arg625和Arg738氨基酸残基提供的静电相互作用，以及小亚基Pro618和Pro94的疏水残基产生的范德华力，能够使复合物定位在细胞膜上，使脱氢酶的催化中心面向周质空间进行催化，并将产物释放到胞外。 .本研究可以为酶分子改造提供理论依据，对推动新型手性配体化合物的设计合成以及合成其它类型的3-酮糖，具有参考价值。