免疫磁珠靶向富集曲霉病原体提高侵袭性曲霉病诊断率的研究

深部真菌病尤其是侵袭性曲霉病发病率随着免疫受损者增多而迅速增高。以真菌培养鉴定、组织病理学检查、真菌抗体和抗原检测以及核酸检测为主的实验室诊断方法，其灵敏度及特异性难以满足早期诊断需求而致该病死亡率高企。血液、体液及组织中真菌含量极微是制约检测方法敏感度的瓶颈。免疫磁珠技术结合抗体高特异性和磁珠的定向流动性，为靶向富集临床标本中真菌以提高检测技术的敏感性提供了理想介质。本课题以曲霉为例，在前期成功获得一组针对曲霉广谱特异性抗原单克隆抗体的基础上，将抗体黏合到磁珠上，通过筛选和优化抗体黏合的磁珠，以达到磁珠靶向富集曲霉最佳效率，通过预先富集侵袭性曲霉患者血液或体液中的曲霉，再结合现有真菌检测技术，从而创建基于免疫磁珠技术的新型曲霉培养、快速鉴定、抗原及核酸检测等系列方法。新方法将有效提高曲霉感染诊断灵敏度，并可望推广至其它深部真菌检测方法研究，为开发临床适用的真菌诊断产品奠定理论基础。

本课题拟建立基于曲霉特异性单抗免疫磁珠进行富集的系列曲霉实验诊断方法，以提高侵袭性曲霉病(IA)诊断率。. 首先，制备曲霉免疫磁珠并捕获富集抗原。采用多种方法用曲霉单抗包被磁珠，包括共价键直接偶联、生物素-亲和素偶联、抗IgG磁珠直接包被IgG型曲霉单抗等均满足要求。但各种抗体包被组合：广谱结合位点曲霉单抗、所有IgG型曲霉单抗以及免疫兔血清等，均未见免疫磁珠显著的富集作用，提示抗原捕获能力欠佳，需重新筛选单抗。. 其次，成功建立了一系列曲霉免疫诊断方法和分子诊断方法：.1. 采用重组烟曲霉特异性甘露聚糖蛋白片段（Afmp1cr/Afmp2cr）建立双抗原夹心ELISA法.烟曲霉特异性甘露聚糖蛋白（Afmp)是烟曲霉菌丝细胞壁抗原，烟曲霉感染的抗原检测靶标，Afmp1cr与Afmp2cr 为afmp基因保守区编码蛋白片段(conserved regions)。两种双抗原夹心捕获烟曲霉特异性抗体ELISA灵敏度分别为1:800（Afmp1cr）和1:3200(Afpmp2cr)稀释兔血清；特异性：两种方法检测94份健康人血清A450为：均值0.1029，SD0.l0089，cutoff值0.147（Afmp1cr）和均值0.0858，SD0.0198，cutoff值0.099（Afmp2cr）；其它微生物（念珠菌等）感染血清均低于cutoff值。临床应用显示可检测出确诊或拟诊IA患者血清中的曲霉抗原。.2. 建立了两种烟曲霉抗原Afmp1p和Afmp4p抗原捕获双抗体夹心ELISA法；Afmp1p和Afmp4p是Afmp同源蛋白。两种ELISA法的灵敏度分别为400（rAfmp1p）和800pg/ml（rAfmp4p）；特异性好，各类病原体培养上清和兔感染血清，5种病原曲霉均能检出，马尔尼菲青霉、新隐球菌及念珠菌为阴性。.3. 建立了以曲霉18SrDNA基因为靶标的实时荧光PCR方法。该法能检测多种曲霉和青霉的临床标本，不能检测到其他病原，灵敏度达105个/ml烟曲霉孢子。.4. 建立了一个小型的侵袭性真菌病血清标本库。收集过程中对规范围手术期抗菌药物合理应用进行了研究。.5. 建立了其他真菌白念珠菌感染特异性Csa2蛋白双抗体夹心ELISA法。. 该课题发表了3篇中文核心期刊论文，培养硕士研究生1名。总体上完成研究目标。