双功能纤维二糖磷酸化酶TaCBP宽泛的底物特异性的结构基础研究

The partial hydrolysis paradigm requiring partial hydrolysis of cellulose yielding cellobiose and cellodextrin which in turn are directly transported and assimilated in the cell, inspired by naturally cellulolytic microorganism, has been considered as a promising strategy for high-efficient cellulose degradation and utilization. Compared to hydrolysis catalyzed by β-glucosidase, hydrolysis of cellobiose and cellodextrin in the cell catalyzed by cellobiose phosphorylase (CBP) and cellodextrin phosphorylase (CDP) has compelling advantages. So it is significant to discovery novel CBP and CDP. The thermophilic CBP from Thermosipho africanus (TaCBP) is characterized as a bifunctional enzyme with phosphorolytic activity on both cellobiose and cellodextrin. Here we project to solve the crystal structures of TaCBP and complexes with cellobiose and cellodextrin, in order to determine the substrate binding sites and catalytic residues and to reveal the structural basis for its broad substrate specificity. Combining the structural and biochemical information, the key bifunctional catalytic residues and the mechanism of bifunctional TaCBP catalysis on both cellobiose and cellodextrin will be proposed, thus to lay the foundation for engineering of substrate specificity of other CBPs and CDPs and for their industrial application of high-efficient cellulose utilization.

自然界微生物利用纤维素的部分降解模式——纤维素经部分降解生成的纤维二糖和纤维寡糖被直接吸收到胞内利用——已成为纤维素高效降解和利用的新的发展方向。相比于β-葡萄糖苷酶，纤维二糖磷酸化酶（CBP）和纤维寡糖磷酸化酶（CDP）催化的胞内纤维二糖和寡糖的利用途径具有显著的优势，因此发掘新型的CBP和CDP具有重要的理论意义和应用价值。项目组鉴定的新型耐热CBP（TaCBP）具有独特的兼具CBP和CDP活性的双功能催化活性，本项目拟利用X射线晶体学技术解析TaCBP及其与糖类底物复合物的晶体结构，确定TaCBP的催化活性中心，揭示其宽泛的底物特异性的结构基础，并结合酶与底物的相互作用等研究，确定TaCBP双功能催化的关键氨基酸残基，阐明TaCBP同时磷解纤维二糖和纤维寡糖的双功能催化机制，为CBP和CDP底物特异性的改造提供理论依据，为其在纤维素高效降解和利用中的应用奠定理论基础。

糖苷磷酸化酶在多糖的磷解和合成中具有重要的应用。然而，糖苷磷酸化酶的底物特异性调控机制仍不清晰。本研究利用生物信息学、酶动力学以及产物结构测定等方法，确定糖苷磷酸化酶THA_1941（原TaCBP）归属于GH161家族，明确了THA_1941的底物宽泛性。构建了以玉米秸秆为原料，由纤维素酶、纤维二糖磷酸化酶CtCBP以及THA_1941参与的昆布多糖的体外合成体系。为揭示THA_1941底物宽泛性的结构基础，解析了THA_1941及其与纤维二糖、无机磷酸复合物的晶体结构。THA_1941以同源二聚体的形式作为活性单元，由N端β-三明治结构域、螺旋连接、桶状结构域和C端卷曲结构域4部分组成。GH94和GH161家族磷酸化酶结构比对表明，催化结构域中D625所在的催化环以及临近环具有较大的柔性，其结构重排可引起底物结构口袋的尺寸变化，从而限制不同聚合度底物的结合。GH94家族糖苷磷酸化酶CtCBP中催化环内S497G的突变引起CtCBP底物特异性的显著变化和催化活性的明显提升，验证了催化环及邻近环重排对糖苷磷酸化酶底物特异性调控的机制模型。此外，本项目挖掘并改造了DUF152家族新型漆酶来源于Caldicellulosiruptor bescii的Cblac和来源于Geothermobacter hydrogeniphilus的Ghlac，通过Cblac和Ghlac的野生型及突变体结构分析，阐明了其突变体热稳定性提升的结构基础。热稳定漆酶可高效降解有毒染料孔雀石绿，并脱除孔雀石绿对细菌、植物和动物的毒性，显示其在印染废水的生物处理方面的应用潜力。通过序列比对、结构分析以及酶学性质分析等方法确定了DFU152家族漆酶可通过家族内保守的H78、C119和 H136位点结合1个铜离子，参与底物的氧化反应，为该家族漆酶催化机制的阐明奠定了基础。