长牡蛎caspase-8细胞凋亡和免疫调控功能研究

Apoptosis is a fundamental biochemical process for the selective and controlled elimination of cells within multi-cellular organisms. It is regulated by two apoptotic signaling pathways, extrinsic and intrinsic apoptotic pathway. Caspase-8 is a widespread and highly conservative initial apoptotic caspase in vertebrate, and plays important regulatory roles in extrinsic apoptotic signaling pathway. However,little is known whether caspase-8 and extrinsic apoptotic signaling pathway exist in invertebrate. By means of completion of oyster genome project, we have found several homologous genes of extrinsic apoptotic pathway key components in oyster as a representative of mollusks. These results imply that invertebrate may also exist extrinsic apoptosis pathway, and whether Cgcaspase-8 plays the same role as initial caspase in vertebrate will be the answer of the hypothesis. Therefore, on the basis of caspase-8 homologous gene, we will study the expression pattern of Cgcaspase-8 in different physiological and pathological conditions, explore the functions of Cgcaspase-8 in extrinsic apoptotic signaling pathway and innate immune pathway. The results will provide theoretical basis for further study of each components of extrinsic apoptotic signaling pathway in mollusks, and have important theoretical and scientific significance.

细胞凋亡是指多细胞生物中，有选择性的并且可控的细胞死亡过程。细胞凋亡现象由外源性和内源性两条细胞凋亡信号通路调控。Caspase-8是在脊椎动物中普遍存在且高度保守的起始凋亡酶，在外源性细胞凋亡信号通路中发挥了重要的调控作用。然而，在无脊椎动物中是否存在caspase-8和外源性细胞凋亡信号通路还是有争议的。随着牡蛎基因组计划的完成，我们在以牡蛎为代表的软体动物中发现了外源性细胞凋亡信号通路中多个关键组分的同源基因，暗示着无脊椎动物中可能也存在着外源性细胞凋亡信号通路。牡蛎中的caspase-8能否发挥起始凋亡酶的功能，是揭示这一谜底的关键。因此本研究在获得牡蛎caspase-8同源基因的基础上，分析该基因在不同生理和病理条件下的表达模式，研究其在外源性细胞凋亡信号通路和天然免疫信号通路中的功能,为进一步研究软体动物外源性信号通路各组分的功能提供理论基础，具有重要的理论科学意义。

细胞凋亡是多细胞生物为了维持自身细胞产生和死亡的动态平衡，采取的主动的、程序性的细胞死亡过程。细胞凋亡的执行依赖于一类特异的半胱氨酸蛋白酶—凋亡酶，并被分为三条主要的信号通路：线粒体介导的内源性细胞凋亡通路、死亡受体介导的外源性细胞凋亡通路和内质网介导的细胞凋亡信号通路。此外，凋亡酶的激活还被一系列的凋亡抑制蛋白紧密调控，如IAP、bcl-2和bak等。细胞凋亡，尤其是外源性细胞凋亡，在脊椎动物中研究比较充分，但在无脊椎动物中的研究还很少，甚至认为是不存在于无脊椎动物中的。本研究利用分子生物学等实验方法，对长牡蛎外源性细胞凋亡相关基因的同源基因进行克隆鉴定和功能分析，虽然尚未证明外源性细胞凋亡信号通路存在于长牡蛎中，但相关基因参与了细胞凋亡的调控和天然免疫防御过程。. 本研究获得了两个长牡蛎类caspase-8基因，分别命名为Cgcaspase-8-1和Cgcaspase-8-2。这两个基因编码的蛋白质都包含了N末端的串联的两个DED结构域和一个C末端凋亡酶结构域。Cgcaspase-8-1而不是Cgcaspase-8-2与CgFADD和CgRIG-I相互作用，并激活NF-κB报告基因表达，参与了长牡蛎免疫信号通路。然而，CgFADD不与CgTNFR的DD结构域相互作用说明长牡蛎中外源性细胞凋亡信号通路不由CgTNFRs介导，可能与其它死亡受体有关。虽然Cgcaspase-8-1和Cgcaspase-8-2没有脊椎动物caspase-8的活性，但这两个蛋白都能诱导细胞死亡，说明这两个蛋白具有凋亡酶功能。针对细菌和病毒刺激不同的表达模式和不同的亚细胞定位结果表明Cgcaspase-8-1和Cgcaspase-8-2功能上存在分化，Cgcaspase-8-2可能是Cgcaspase-8-1的冗余基因。为深入研究无脊椎动物是否存在外源性细胞凋亡通路打下基础。