外泌体对长牡蛎抗灿烂弧菌免疫应答的调控机制

The exosomes have been confirmed to be involved in innate immune responses and play a pivotal role in the innate immunomodulation. However, the mechanism of immunomodulation mediated by exosomes in invertebrate innate immune system is still unclear. In our previous research, the exosomes isolated from oysters (Crassostrea gigas) stimulated by Vibrio splendidus or Staphylococcus aureus exhibited different feature of component, immune response profile and immunomodulation. Based on such achievements, the present research will be performed based on techniques from biochemistry, cell biology, molecular biology, molecular immunology and bioinformatics, aiming to (1) identified and analysis the component of oyster exosomes in protein, mRNA and microRNA (miRNA) level; (2) explore the immune response profile of these component after the stimulation of V. splendidus; (3) investigate the immunomodulation on immune signaling pathway mediated by exosomes in protein and mRNA level; (4) detect the humoral and cellular immune parameter changes in stimulation by exosomes from different source; (5) explore the immunomodulation mechanism of exosomes in oyster. The results of our research will reveal the mechanism of immunomodulation mediated by exosomes in mollusk and enhance the understanding of the immune defense system in invertebrates.

外泌体及其介导的信息传递是机体极其重要的免疫应答调控机制，也是当前生命科学研究的前沿热点，但是目前对海洋无脊椎动物外泌体及其免疫调控作用的研究极度匮乏。本项目在前期对灿烂弧菌刺激后的长牡蛎外泌体进行了转录组学和miRNA组学分析，并初步检测了其免疫调控作用。拟在此基础上，综合运用各种现代生物学技术手段，从蛋白质、mRNA和miRNA三种水平进一步发掘长牡蛎外泌体的组成成分，并明确这些成分对灿烂弧菌刺激的免疫应答特征；从转录和翻译两种水平测定长牡蛎外泌体对关键免疫信号转导通路的调控，从体液免疫和细胞免疫两个方面检测其对主要免疫指标的调节。综合上述结果，以组成成分为基础，以应答特征为桥梁，以调控机制为主线，初步阐释外泌体对长牡蛎抗灿烂弧菌免疫应答的调控机制。本项目的研究成果将为深入了解软体动物外泌体的免疫调控作用提供有力证据，并为海洋无脊椎动物固有免疫研究贡献新视角、新认知和新成果。

外泌体及其介导的信息传递是机体极其重要的免疫应答调控机制，也是当前生命科学研究的前沿热点，本项目旨在解析海水养殖贝类外泌体介导的先天免疫调节机制。主要成果包括：从长牡蛎外泌体中鉴定出505种mRNA，333种miRNA以及1634种蛋白质，从栉孔扇贝外泌体中鉴定出2481种蛋白质，基本查明了贝类外泌体在mRNA、miRNA和蛋白质三种水平的主要组成成分。在灿烂弧菌刺激12小时后，长牡蛎外泌体中有42种mRNA表达量上调，57种mRNA表达量下调；有52种miRNA上调，能够靶向调控886种基因的表达量，有55种miRNA下调，能够靶向调控1162种基因的表达量；有76种蛋白质表达量上调，355种蛋白质表达量下调。在金黄色葡萄球菌刺激12小时后，长牡蛎外泌体中有21种mRNA表达量上调，47种mRNA表达量下调；有37种miRNA上调，够靶向调控653种基因的表达量，36种miRNA下调，能够靶向调控657种基因的表达量；有99种蛋白质表达量上调，152种蛋白质表达量下调。总体而言，长牡蛎外泌体对灿烂弧菌的响应程度略强于对金黄色葡萄球菌的响应程度。以脂多糖刺激扇贝来源的外泌体与正常扇贝来源外泌体对于受体栉孔扇贝转录组、miRNA组和蛋白质组的差异调控作用研究结果为依据，选择并检测了外泌体对12条重要免疫信号转导通路的调控作用，结果表明贝类外泌体对于MyD88依赖TLR通路、MyD88非依赖TLR通路、RIG-I/MDA-5/MAVS通路、TNF通路、NF-κB通路等5条重要免疫信号转导通路具有显著的调控作用；选择并检测了外泌体对24种主要免疫指标的调节功能，结果表明贝类外泌体对于超氧化物歧化酶、过氧化物酶、酚氧化物酶、溶菌酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、血清抑菌/抗菌能力、总抗氧化能力、呼吸爆发水平、脂质氧化水平、亮氨酸脑啡肽、甲硫氨酸脑啡肽、细胞凋亡水平、细胞吞噬水平、细胞自噬水平和包囊化活力等免疫指标或者免疫活性均有显著的促进作用。本项目综合成分鉴定与免疫调控两方面的研究成果，以组成成分为基础，以应答特征为桥梁，以调控机制为主线，初步阐释了外泌体对贝类先天免疫应答的调控机制。