循环miRNA内参筛选及其在胃癌血清miRNA分子标志物研究中的应用

近三年的研究证实，存在于血液中的血清/血浆miRNA（循环miRNA）十分稳定,且与疾病关系密切，具有成为疾病分子标志物的最佳条件。然而，循环miRNA的研究刚刚起步，由于循环miRNA检测无公认可靠的内参miRNA（housekeeping miRNA），使相关研究变得困难、研究结果可靠性下降，循环miRNA的研究和应用急需解决内参问题。本项目拟在一定规模人群中，通过TLDA miRNA芯片筛选和TaqMan定量PCR多重验证，确定可靠的循环miRNA内参。该研究所筛选的内参可直接应用于循环miRNA的研究和检测，具有极大的现实意义。接着，该项目拟将所筛选内参应用于胃癌血清miRNA分子标志物的筛选与验证，获得较以往更可靠的胃癌血清miRNA标志物。并结合临床，观察其作为观测指标对胃癌早期诊断、疗效监测和预后评价的有效性和可靠性，为胃癌血清miRNA诊断方法的建立和试剂盒的开发提供依据。

近年来，循环miRNA研究正在兴起，由于其存在于血液中且十分稳定，是寻找疾病标志物的理想材料。但是，循环miRNA检测无公认可靠的内参miRNA，循环miRNA的研究和应用急需解决内参问题。本项目在一定规模人群和疾病类型中，使用miRNA芯片初筛和定量PCR验证方法，筛选逐步排除和筛选循环miRNA内参；此外，通过以上方法，对胃癌治疗前后血清miRNA进行比较分析，筛选可能用于胃癌疗效评价、复发监测、预后预测和早期诊断的血清miRNA标志物。结果显示：通过芯片提示并在110例健康人群和肿瘤患者血清中验证，证实之前用于细胞和组织miRNA的内参U6并不适合作为循环miRNA的内参；通过对6块miRNA芯片结果的分析并结合文献，选择miR-191、miR-142-3p、miR-24、miR-186、miR-19b、miR-135*、U6、miR-16 、miR-1228、miR- 93、miR-192作为候选内参，进一步扩大样本，通过定量PCR多重验证，结合软件geNorm、Bestkeeper、NormFinder和△△CT法进行筛选，筛选到最适宜的血清内参基因为miR-191和miR-24。通过在血浆中验证，证实miR-191和miR-24同样适宜在血浆中作为血浆miRNA内参。在胃癌循环miRNA标志物研究方面，已经有少量文献报道，通过对胃癌患者于健康人群的血清\血浆miRNA进行比较研究，筛选胃癌诊断标志物，但其结果不太一致，分析原因，可能是筛选过程中存在个体差异。我们对胃癌患者治疗前后血清miRNA表达谱进行了比较研究，并通过定量PCR对同一样本治疗前后血清miRNA进行比较，初步筛选到胃癌治疗前后差异表达的miRNA有let-7g-5p、miR-30e-5p、miR-454-3p、miR-449a、miR-410-3p、miR-30a-5p、miR-15b-5p、miR-20a-5p、miR-520e、miR-181b-5p，进一步的筛选验证正在完善中，并将结合临床治疗效果与随访情况，分析其在评价疗效、监测复发及预测预后中的作用及效率。此外，通过观察胃癌治疗前后差异表达miRNA在胃癌患者及健康人群中的表达情况，分析其是否同样可以用于胃癌的早期诊断。该研究所筛选的内参可直接应用于循环miRNA的研究和检测，解决该领域研究与应用的瓶颈问题，具有极大的现实意义。