去泛素化酶OTUD3调控p53蛋白稳定性的机制研究

P53 is implicated in the pathogenesis of various types of human tumors. The p53 protein stability is critical for maintaining its tumor suppressor function. We found that the deubiquitinase (DUB) OTUD3 （OTU domain containing protein 3),one of the 90 human DUB members, can bind and stabilize p53. Specifically, OTUD3, by removing the polyubiquitination chain from p53, prevents its proteasomal degradation. Depletion of OTUD3 by RNA interference resulted in significantly shortened half life of p53. These data suggest that OTUD3 is a critical factor in regulation of p53 stability. In this proposal, we aim to investigate the interaction between OTUD3 and p53 at molecular, cellular levels, in animal model and clinical samples to demonstrate that OTUD3 plays a critical role in maintianing p53 protein levels. The protein domains mediating OTUD3-p53 interaction will be identified; the mutations of OTUD3 and p53 in tumor tissues will be screened and analyzed to reveal how they affect the genesis/progression of the tumors. These studies should determine if OTUD3 is a tumor suppressor, and provide mechanistic insights into tumor development and progression. This work represents the first effort to demonstrate that OTUD3 maintains p53 stability, and may identify a new therapeutic target.

p53与多种肿瘤的发生发展关系密切，蛋白稳定性的维持对于其正常发挥抑癌功能具有重要意义。我们在去泛素化酶（DUB）的90个成员中发现OTUD3能够特异结合并增强p53稳定性，它通过去除p53的泛素化修饰抑制其降解。敲低OTUD3可导致p53的半衰期缩短，泛素化降解加快。因此，OTUD3是一个十分重要的p53稳定因子。本项目拟在分子水平、细胞生物学水平、动物水平以及临床水平上针对OTUD3与p53的关系展开系统性研究，确证OTUD3在维持p53蛋白稳定性中的重要性；筛查肿瘤组织中OTUD3与p53的突变，从分子机制上分析这些突变在肿瘤发生发展过程中的作用；通过细胞生物学和临床病例研究，获取OTUD3具有抑癌蛋白功能的证据。本课题首次提出OTUD3 具有维持p53 稳定性的功能，研究结果将为肿瘤发生发展的机制研究提供新思路，为肿瘤的临床治疗提供新靶点。

背景:P53通路失活在乳腺癌肿瘤发生过程中起重要作用，其中，翻译后蛋白修饰异常已被证实是p53失活的重要机制。大量的去泛素化酶在乳腺癌中异常表达，但是只有少数去泛素化酶被证实能够去泛素化并稳定p53，在这里我们首次报道OTUD3是一个重要的去泛素化酶，与乳腺癌发生发展有关，并且能否稳定p53。主要研究内容：应用Kaplan-Meier绘图仪检测OTUD3、TP53、PTEN mRNA表达与乳腺癌预后的相关性；通过免疫组织化学和Western Blot检测齐鲁队列中80对临床乳腺癌与癌旁组织标本中OTUD3蛋白的表达，并分析了OTUD3、p53和p21蛋白之间的关系；通过半衰期实验和泛素化实验进一步阐明OTUD3稳定p53的分子机制；通过共免疫沉淀实验和GST pulldown实验验证了OTUD3和p53在BC细胞中的相互作用；采用MTS增殖检测、凋亡检测试剂盒和菌落形成检测等方法，研究OTUD3对乳腺癌细胞生物学功能的影响。重要结果:临床水平上，OTUD3表达下调与乳腺癌患者预后不良相关；OTUD3在乳腺癌组织中的表达降低，与组织学分级无关，并且OTUD3表达与野生型p53、p21表达显著正相关。细胞水平上，OTUD3还能抑制细胞增殖和克隆形成，增加乳腺癌细胞对化疗药物诱导的凋亡的敏感性。分子机制上，野生型OTUD3的表达可以稳定并激活p53：OTUD3通过氨基末端的OTU区域直接与p53相互作用；OTUD3可以保护p53不受mdm2介导的泛素化和降解，使p53在乳腺癌细胞中去泛素化。.结论:综上所述，我们认为OTUD3是恢复乳腺癌细胞p53功能的潜在治疗靶点，并提示OTUD3-p53信号轴在肿瘤抑制中发挥重要作用。