葡萄霜霉菌无毒基因AvrRpv1参与的菌株毒力变异分子机制研究

The yield and quality of grape can be seriously damaged by grape downy mildew. This disease is particularly serious in Guangxi with high temperature and rainy weather. Previously, the downy mildew resistance gene Rpv1 was cloned from M. rotundfolia. A lot of P. viticola isolates were collected from different cultivars. The pathogenicity and genetic relationship analysis revealed that two isolates with the least genetic difference showed avirulence and virulence on the Rpv1+ plants. On this basis, this project is to identify the secretome differences between avirulent isolate and virulent isolate by comparative genomics and transcriptomics analysis. At the same time, the sequence differences between multiple avirulent and virulent isolates and the transient transformation of grape leaves are used to identify the avirulence gene AvrRpv1 which is specifically recognized by Rpv1. In addition, Y2H is used to preliminarily test whether Rpv1 interact with AvrRpv1 directly or not. If yes, the interaction is to be confirmed by BiFC and Co-IP. If not, the AvrRpv1 bait vector was used to screen the cDNA library of Rpv1-transgenic grape leaves which was infected by an avirulent isolate to get its target protein. The cloning of avirulence gene AvrRpv1 and the mechanism of virulence variation in different strains mediated by AvrRpv1 can provide new strategies and ideas for comprehensive prevention and control of grape downy mildew and resistance breeding of grape downy mildew. This project is of great value in theory and practice.

葡萄霜霉病严重危害葡萄产量和品质，在广西高温多雨的气候条件下发病尤其严重。前期我们克隆得到了霜霉病抗性基因Rpv1，收集了多个霜霉菌菌株，致病力和遗传关系分析发现了两株遗传差异最小，但对Rpv1+植株分别无毒、有毒的两株菌。在此基础上，本项目拟通过比较基因组和转录组数据分析，挖掘两株菌分泌蛋白组存在的差异；同时，结合多个有毒、无毒菌株中序列的差异及葡萄叶片瞬时转化技术，鉴定Rpv1特异识别的无毒基因AvrRpv1；此外，利用Y2H初步验证Rpv1与AvrRpv1是否存在直接互作；若存在，则利用BiFC和Co-IP进一步确认；若不存在，则利用AvrRpv1诱饵载体筛选无毒菌株侵染的Rpv1转基因葡萄叶片的cDNA文库，获得其靶标蛋白。无毒基因AvrRpv1的克隆及其参与的不同菌株毒力的变异机制研究，可以为葡萄霜霉病的综合防控和葡萄霜霉病抗性育种提供新的策略和思路，具有重要的理论和实践意义。

葡萄霜霉病严重危害葡萄产量和品质，在广西高温多雨的气候条件下发病尤其严重。前期我们克隆得到了霜霉病抗性基因Rpv1，收集了多个霜霉菌菌株，致病力和遗传关系分析发现了两株遗传差异最小，但对Rpv1+植株分别无毒（非亲和）、有毒（亲和）的两株菌。同时，我们还加测了澳洲的两株非亲和菌株，在最终数据分析时加入了法国发表的非亲和菌株的全基因组测序数据。在这些基因组数据的基础上，本项目通过比较基因组，并结合转录组数据，挖掘不同菌株分泌蛋白组存在的差异；同时，选择非亲和菌株共有的，亲和菌株没有的分泌蛋白，作为候选蛋白。构建候选无毒基因的过表达载体，利用烟草、葡萄叶片瞬时转化技术和表型观察，筛选到可以在含有Rpv1抗性基因的植株上产生典型的HR反应的效应蛋白Avr284作为候选的AvrRpv1。同时，进一步在含有Rpv12和Rpv23抗性位点的植株上接种无毒基因的菌株，通过表型进一步确认AvrRpv1与Rpv1之间的特异识别；而且，对全基因组基因按家族为单位基于位置分布的分析发现，大量的糖基水解酶、几丁质酶、CRN等分泌蛋白，以及糖转运、生殖、杀菌剂靶标等非分泌蛋白，均存在明显的串联重复现象，且其串联重复发生的频率与对应家族的扩张程度呈显著正相关。以上研究结果表明，串联重复是葡萄霜霉菌基因组进化的重要策略，对于葡萄霜霉菌致病力增强、快速增殖及菌株适应性的进化具有重要意义。此外，我们还克隆并验证了过量表达查尔酮合成酶可以提高葡萄对霜霉病和灰霉病的抗性。无毒基因的克隆及其参与的不同菌株毒力的变异机制研究，以及查尔酮合成酶基因的功能验证，可以为葡萄霜霉病的综合防控和葡萄霜霉病抗性育种提供新的策略和思路，具有重要的理论和实践意义。