不动杆菌CR-3降解反式-4-甲基-环己烷酸机理研究

环烷酸污染是近年来伴随石油工业发展而产生的一种新环境问题，已引起国际社会和科学界的关注。目前，环烷酸微生物降解研究尚处于起始阶段，人们对其在环境中的微生物降解几乎不了解。环烷酸微生物降解机理尚属未知，是石油污染生物修复研究领域的前沿问题。本项目拟以反式-4-甲基-环己烷酸为模式化合物，从前期筛选的高效环烷酸降解菌株CR-3出发，研究CR-3的基本生长规律，表征其降解特性；采用GC-MS测定CR-3降解反式-4-甲基-环己烷酸的代谢中间产物和最终产物，解析其降解过程，阐明其降解代谢途径；利用新颖高效的pMiniHimar RB1转座系统，构建突变体文库，鉴定和分析CR-3降解反式-4-甲基环己烷酸的新功能基因，从分子水平上探索CR-3降解反式-4-甲基-环己烷酸的机理。本项目研究结果可为揭示环烷酸微生物降解机制提供理论依据，对今后构建高效基因工程菌、修复环烷酸污染具有重要的实际意义。

环烷酸是油砂处理废水中毒性最强的成分之一。作为一种新的环境问题，环烷酸废水污染已引起国际社会和科学界的关注。但是，环烷酸微生物降解研究尚处于起始阶段，人们对环烷酸微生物降解分子机理的了解还十分有限。本项目以反式-4-甲基-环已烷酸（简称4MCHCA）为模式污染物，利用环烷酸降解菌Cupriavidus gilardii CR3，深入地开展了4MCHCA的微生物降解机理研究。主要研究结果如下：.（1）明确了Cupriavidus gilardii CR3的生长特性、对不同环烷酸降解谱和最佳生长条件。C.gilardii CR3生长量符合“S”型增长。CR3对环烷酸降解谱较宽，最佳生长条件为温度28℃、pH=7、摇速为200rpm。.（2）建立微生物降解体系中4MCHCA的GC-MS测定方法，揭示了环烷酸降解菌C. gilardii CR3对4MCHCA的降解特性。Cupriavidus gilardii CR3对环烷酸有较好的降解能力，对25-50mg/L环烷酸的降解效率在55%-75%，100mg/L环烷酸的降解效率为45%。.（3）首次完成了Cupriavidus gilardii细菌的全基因组测序，获得了高质量的图谱特征。结合中间产物化学分析和CR3的功能基因组学分析结果，推测CR3对4MCHCA的降解途径可能存在17条代谢通路。.（4）利用HPLC/Q-TOF-MS检出C.gilardii CR3降解4MCHCA的2个相对分子量分别为174和156的中间产物。2个中间产物分别为3-甲基-庚二酸（C8H14O4）和5-甲基-2-庚烯二酸（C8H12O3）。.（5）首次构建了C. gilardii CR3降解4MCHCA的途径。 CR3对4MCHCA的降解过程为复杂多步生物反应。4MCCA首先通过5步反应实现邻位开环。开环后，链经过2条途径降解。第一途径最后降解为乙醛；第二条途径产生3-甲基-庚二酸，在延胡索酸还原酶的作用下，3-甲基-庚二酸还原为5-甲基-2-庚烯二酸。.（6）识别了C.gilardi CR3降解4MCHCA的基因。开环基因包括aliA、aliB、badH、badl基因和一种未定名基因。链段裂基因包括DCAA、echA、fadN、fadN、fadB、fadA、atoB、putA和3种未定名基因。这些基因编码了CR3降解4MCHCA的酶。