利用斑马鱼和金线鲃对洞穴鱼眼睛退化机制和眼睛发育调控网络的研究

The genus Sinocyclocheilus, which is endemic to China, show astonishing diversity of adaptive features, with different degrees of eye degeneration. Cave Sinocyclocheilus is a good model for studying the evolution of cavefish and is also a natural model of the eye defects. The research on this model will help understand the eye development and the evolutionary mechanism of cavefish. We have succeeded in reporting the study of the RNA-seq on cavefish eyes and found some candidate genes that may lead to eye degeneration in cave Sinocyclocheilus. However, the longer growth cycle and the extra whole genome duplication make it difficult to clarify the mechanism of the candidate genes by the methods of developmental biology. In this proposal, we aim to decipher the molecular mechanism of eye degeneration in the cavefish using the zebrafish, a carp species. Based on the results on the histology, transcriptome and denovo genome sequencing of Sinocyclocheilus, we will screen a number of candidate genes that may play the regulatory role in the eye development, and study their biology functions by using Cas9-sgRNA technology to construct zebrafish mutant. This proposal will not only help us understand the regulation network of eye development, but also elucidate the molecular mechanism of eye degeneration in the cave Sinocyclocheilus.

金线鲃属是我国特有的洞穴鱼类，该属鱼类表现出令人惊讶的洞穴适应性特征多样性，眼睛呈现从减小到完全缺失的连续形态变化。洞穴金线鲃即是研究洞穴生物演化的优秀模型，也是天然的眼睛缺陷模型，对其进行深入研究将有助于加深人们对于眼睛发育和洞穴鱼类演化机制的认识。我们应用转录组测序对洞穴金线鲃眼睛进行研究，发现多个可能导致其眼睛退化的候选基因。但由于金线鲃较长的生长和繁殖周期以及额外的全基因组加倍，难以利用发育生物学等方法对候选基因的具体作用机制开展研究。因此，本项目拟利用同为鲤科鱼类的斑马鱼作为模式动物，在已有对洞穴金线鲃组织学和转录组研究的基础上，结合金线鲃全基因组重测序分析，筛选鉴定若干在眼睛发育过程中发挥调控作用的候选基因；并利用Cas9-sgRNA技术构建以上候选基因的突变体斑马鱼，研究其体内生物功能，完善眼睛发育调控网络，阐明洞穴金线鲃眼睛退化的分子机制。

金线鲃属是我国特有的洞穴鱼类，该属鱼类表现出丰富的洞穴适应性特征，如眼睛和色素的减小到缺失、侧线和嗅觉的增强等，是研究洞穴生物演化的优秀模型，对其进行深入研究将有助于加深人们对于洞穴鱼类演化机制的认识。本项目通过组织野外考察采集洞穴鱼样品，利用基因组重测序、脂定量组学、RNA-seq、CRISPR/Cas9基因敲除技术，分别研究了5个金线鲃代表种的基因组进化；洞穴金线鲃眼、脑和肝的脂代谢适应；候选基因的体内生物功能。发现相对于地表种，两种金线鲃基因组上特有的有害突变主要富集在天然免疫相关、脂肪酸合成和糖代谢等信号通路，这可能与其洞穴适应相关；发现rd3和rd3b在斑马鱼视网膜感光细胞的外节基盘形成过程中具有重要作用，在瓦状角金线鲃中rd3b的显著下调可能是导致其眼睛退化的原因之一；发现地表鱼大脑中DHA-脂质的优先积累，而洞穴鱼大脑中ARA-脂质的显著增加。特异性多不饱和脂肪酸的优先积累延伸到两种鱼类形态的肝脏和眼睛，这可能是因为DHA膜脂在介导对地表鱼在开放环境中生存至关重要的复杂运动和视觉功能中的关键作用。我们还发现了洞穴鱼后脑中缝5-羟色胺能神经元的选择性脱髓鞘和脂肪肝的发育，这分别代表了重要的代谢调整，有助于消除复杂的社会行为和增加能量储存，有助于洞穴生活的行为适应。另外，还对洞穴鱼皮肤色素缺失机制进行研究，发现洞穴鱼皮肤内黑色素细胞和黑色素小体数目急剧减少，RNA-seq结果显示多个色素合成相关酶类表达下调，深入研究发现由于剪接位点突变，洞穴鱼mitfa缺失21个氨基酸，减弱其对下游黑色素生成基因表达调控，最终洞穴鱼皮肤白化。本项目通过利用多种组学手段和多种实验技术对洞穴鱼的多个器官的适应性演化机制做了深入研究，为深入探讨洞穴生物的演化机制提供了多项实验数据支持。