野油菜黄单胞菌中黄原胶分子聚合度与侧链修饰的调控机制

Xanthan gum is a kind of macromolecular polysaccharide with important industrial applications, the polymerization degree and the modification of side chain determine its rheological properties and impose significant effects on its application. Investigating the regulatory mechanism of polysaccharides polymerization and side chain modification lay the foundation for developing robust gum-producing strain meet various demands in industrial processes as well as promoting the industry international competitiveness. In this study, we firstly propose to investigate the role of predicted seven genes on xanthan gum polymerization and side chain modification, and identify genes participate and affect the gum biosynthesis by screening genome-scale insertional mutant library of Xanthomonas campestris-28 using Tn5gusA transposons. Subsequently, the cooperative contribution of different genes to gum biosynthesis will be investigated. Secondly, investigate the regulatory mechanism of subunit polymerization and side chain modification by “omic” analysis between mutans and host stain. Thirdly, evaluate the effect of fermentation conditions on the polymerization and modification and elucidate the behind molecular mechanism based on intracellular responses with respect to the environmental stimulates on “omic” level. These studies will contribute to developing the system strategies for engineering the next-generation excellent microbial factory of xanthan.

黄原胶是一种具有重要工业应用价值的高分子多糖，其糖链聚合度及侧链修饰度决定了其应用性能。研究黄原胶分子聚合与侧链修饰的调控机制，可为构建高性能产胶菌株，满足不同的工业需求，提升产业国际竞争力奠定基础。本项目拟以一株黄原胶高产菌野油菜黄单胞菌-28为对象，对参与糖链延伸与侧链修饰的7个基因进行功能研究，同时利用Tn5gusA转座子随机突变在基因组水平寻找参与产胶过程的基因。在确定参与黄原胶合成及调控的基因基础上，研究这些基因间的协作关系以及对糖链延伸及侧链修饰的影响；通过对不同突变体与出发株的组学分析与数据整合，进一步研究糖链延伸与侧链修饰的生物过程和调控机理；同时研究不同发酵条件对黄原胶聚合度及侧链修饰度的影响，通过细胞对不同环境条件响应的组学分析，研究外界环境因子影响糖链延伸与侧链修饰的分子机制。上述研究将为构建高性能的黄原胶细胞工厂奠定重要理论基础。

黄原胶是当今世界上生产规模最大，用途最为广泛的微生物多糖。随着在食品、采油、建筑等领域的应用不断拓展，天然黄原胶已不能满足应用需求。阐明黄原胶合成基因与分子结构的关系，构建分子可控的细胞工厂，大幅度提升胶体应用属性，是黄原胶产业发展的重要方向。本项目通过基因组测序、生物信息学分析和蛋白质组学等手段挖掘黄原胶合成相关基因，通过基因敲除和过表达研究这些基因（gum基因簇、O-抗原合成基因、血红蛋白等）或基因组合对产胶能力、胶体结构和性能的影响，建立了基因与结构、性能的关系：gumFGL参与调控侧链修饰度，其表达量与侧链乙酰化、丙酮酸修饰度成正相关；gumBCE参与调控糖链聚合度，提高gumBCE表达量可显著提升黄原胶粘度；gumDHIJKM可通过提高侧链饱和度提高黄原胶的粘度和耐温性；敲除竞争途径（O-抗体途径），可显著提升黄原胶产量，最高提高52%，粘度提高5%；适量表达血红蛋白Vgb，可提高细胞携氧能力，使黄原胶产量提高4%，粘度提高4%。基于以上研究结果，针对不同应用需求，本项目构建了3株基因工程菌株，分别在复配性能、耐温、耐酸、粘度等性能方面较出发菌株提高了48%、100%、57%、291%，并建立相应的发酵和后处理工艺，黄原胶产量达到30g/L，产品粘度较商品化黄原胶提高了75%。初步完成了黄原胶产品在油田中的应用开发，获得了新型油田调剖剂。该成果推广应用后可大幅提升我国微生物多糖生产技术水平，丰富国内企业多糖产品种类，提升多糖产品性能，满足不同工业应用需求，促使国内多糖企业转型升级，增强我国多糖产业国际竞争力。