依赖Na+的新型PiT家族转运蛋白SdpsT的功能鉴定及其重要氨基酸残基的功能分析

Preliminary experiments suggest that SdpsT may be a novel PiT family transporter with Na+(Li+)/H+ antiport activity, but its function hasn’t been identified experimentally as yet. In this project, we plan to identify the exact function of SdpsT as a novel PiT family transporter by analyzing the uptake of 32P labeled inorganic phosphate or 35S labeled inorganic sulfate based on RSO membrane vesicles containing pUC-sdpsT. Also, we plan to identify whether SdpsT extrudes Na+ indenpendtly as a Na+(Li+)/H+ antiporter or SdpsT extrudes Na+ as a PiT family transporter by being coupled to the transportation of inorganic phosphate or inorganic sulfate through the acridine orange fluorescence dequenching method based on inverted membrane vesicles or by analyzing the uptake of 22Na+ by inverted membrane vesicles containing pUC-sdpsT. As a novel PiT family transporter, identification of SdpsT will be very helpful to not only understand molecular mechanism of inorganic phosphate or inorganic sulfate transportation by SdpsT and halo-alkali tolerant molecular mechanism of SdpsT, but also enhance our knowledge of the key role of PiT family transporters and Na+(Li+)/H+ antiporters in bacterial halo-alkali tolerance.

前期研究暗示SdpsT是一个可能具有钠（锂）/氢逆向转运蛋白功能的新型PiT家族转运蛋白，但其确切功能仍然未定。因此，本项目拟采用基于RSO膜微囊的同位素32P或35S标记的检测技术，鉴定SdpsT具体作为何种PiT家族转运蛋白行使功能；采用基于反转膜微囊的吖啶橙荧光猝灭恢复法或同位素22Na的检测技术，鉴定SdpsT具体是通过行驶钠（锂）/氢逆向转运蛋白功能输出Na+，还是通过偶联PiT家族转运蛋白功能输出Na+。作为新型PiT家族转运蛋白，SdpsT的功能鉴定，不仅可以揭示该蛋白转运无机磷酸/无机硫酸以及耐盐碱的分子机制，而且可以增进人们对PiT家族转运蛋白和钠（锂）/氢逆向转运蛋白在细菌耐盐碱方面的认识。

在本研究中，为了对SdpsT的准确功能进行鉴定，我们将SdpsT构建于表达载体pET19b，并转入大肠杆菌（E. coli）EP432（ΔnhaA, ΔnhaB）。耐盐碱测试表明SdpsT在大肠杆菌（E. coli）EP432中成功表达，可以用于后续Na+（Li+，K+）/H+逆向转运蛋白活性测试。Western blot检测显示，SdpsT定位于细胞质膜。AO荧光猝灭法对其进行蛋白活性检测，表明SdpsT具有Na+（Li+，K+）/H+逆向转运蛋白的活性，并且具有pH依赖性。转运动力学研究表明，Na+、Li+、K+在EP432中K0.5值分别是0.10 ± 0.05 mM、0.57 ± 0.03 mM、0.43 ± 0.06 mM，即SdpsT对Na+、Li+、K+的亲和力分别是Na+ > K+ > Li+。我们进一步通过系统发育分析，发现SdpsT代表一类新型的Na+（Li+，K+）/H+逆向转运蛋白。系统发育学分析和序列比对结果表明SdpsT属于PiT家族蛋白，可能具有转运无机磷酸和（或）硫酸的功能。因此，我们采用同位素示踪技术，以32P和35S检测SdpsT的吸收特性，结果表明，SdpsT在Na+浓度≥ 50 mM时具有吸收无机磷酸的能力而不具有吸收无机硫酸的能力。为了进一步验证该实验结果，我们应用Red同源重组技术敲除大肠杆菌K12中与无机磷酸、硫酸转运相关的基因，即pitA、pstA、cysA和cysZ，获得双突变株E. coli K12ΔpitAΔpstA和E. coli K12ΔcysAΔcysZ，并进行SdpsT的功能互补验证，结果表明SdpsT能利用M56培养基中的无机磷酸而不能利用M9培养基中的无机硫酸，此结果与同位素实验结果是一致的。基于以上结果，SdpsT同时具有依赖Na+的无机磷酸转运蛋白和Na+（Li+，K+）/H+逆向转运蛋白功能且SdpsT应该可以采用独立行使Na+（Li+，K+）/H+逆向转运蛋白活性的方式输出Na+。本项目的研究成果在于：证实SdpsT为PiT蛋白家族新成员，同时代表一类新型的Na+（Li+，K+）/H+逆向转运蛋白。首次报道了PiT蛋白家族成员具有Na+/H+逆向转运蛋白活性。以上研究结果对进一步揭示PiT蛋白家族蛋白功能，拓宽对Na+/H+逆向转运蛋白的认识均具有重要理论价值。