外泌体中HLA-G分子诱导肾脏移植免疫耐受的机制研究

The previous study showed that the nonclassical human leukocyte antigen-G (HLA-G) acted as a tolerogenic molecule with undefined method and mechanism. Based on the preliminary confirmed HLA-G molecule existing in the plasma exosome of kidney transplantation recipients, this application proposes that HLA-G molecue in the exosome may be an important existing form with immunosuppressive function in inducing the immune tolerance after kidney transplantation. Firstly, the isolated exosome from the plasma samples of the recipients will be used to study the ratio of HLA-G in the exosome to the free status, and the existing status of this functional molecule with different isoforms, polymerization and types of posttranslational modification. To further study the biological characteristics of HLA-G molecule in the exosome microenvironment to distinguish from the classical interaction pattern; Secondly, to clarify the molecular location, intracellular signal transduction and the changes of cell biological activity of HLA-G molecule after combination with its receptor molecule KIR2DL4 (expressed in NK cells). Finally, following the enrichment of HLA-G positive exosome, the experiment will be carried out on the kidney transplantation model in mice with the application of exosome to induce the immune tolerance in vivo. This research also can be achieved as a foundation of the exosome application for the clinical therapy in inducing immune tolerance.

已有研究显示非经典HLA-G分子具有免疫耐受特性，但其作用方式及机制不甚明确。本申请在初步证实HLA-G分子表达存在于肾移植受者血浆中的外泌体基础上，提出外泌体是HLA-G发挥作用的重要形式，可能是肾移植建立免疫耐受的重要途径。首先，通过分析肾移植受者外周血HLA-G分子在外泌体中存在的比例，观察肾移植术后受者特殊免疫状态下HLA-G在其中的亚型分布、聚合及修饰状态；进一步研究在外泌体这一微环境中HLA-G分子的生物学特性，是否有别于细胞之间直接接触或与游离分子相互作用的方式；其次，明确外泌体中HLA-G分子与其受体分子KIR2DL4结合后的细胞内分子定位，细胞内信号转导以及细胞生物学活性的变化；进而将富集的含有HLA-G的外泌体应用于小鼠肾脏移植模型，体内验证外泌体中HLA-G分子能够诱导移植后免疫耐受。本研究可为实现将外泌体作为诱导免疫耐受的工具应用于移植等领域奠定基础。

同种异体排斥反应是引起器官移植失败的最主要原因，诱导免疫耐受能够显著延长肾脏移植物的存活时间。HLA-G是一种非经典 HLA-I 类分子，具有诱导免疫耐受的生物学特性，然而其在器官移植中的作用方式及机制均不甚明确。课题组收集了肾移植患者的临床样本，发现相对于肾功能稳定组，排斥反应组T细胞和B细胞表面HLA-G表达显著降低，而HLA-G受体ILT2的表达则没有显著的变化。为了进一步探讨机制，我们分离了肾移植患者血浆中的外泌体，透射电镜显示外泌体呈椭圆形或者茶杯型，NTA分析外泌体粒径分布大部分在100nm以内，Western结果显示分离的外泌体高表达CD9、CD81和TSG101等特征性蛋白。流式细胞术结果显示排斥患者CD4+CXCR5+外泌体上HLA-G的表达显著低于耐受组，在抗体介导的排斥反应（AMR）和Non-AMR之间则没有显著的统计学差异，这说明外泌体HLA-G可作为一个靶点用于肾脏移植后排斥反应的监测。体外研究显示外泌体介导了HLA-G在免疫细胞间的靶向传递，具有调控免疫反应的功能。排斥患者低表达HLA-G的CD4+CXCR5+外泌体会促进B细胞增殖、分化为浆细胞，增加排斥反应的发生风险。基于上述研究，我们利用间充质干细胞源性外泌体构建组织工程血管，可以靶向结合内皮祖细胞，递送siRNA，移植的血管可维持长时间的通畅，不会引起严重的免疫排斥反应和炎症反应。基于外泌体和适配体，我们采用层层自组装的方式构建靶向递送HLA-G的纳米材料。透射电镜显示这种外泌体周围有一层纳米材料包裹，流式细胞术显示外泌体的粒径没有显著的改变。移植动物实验结果显示靶向递送HLA-G外泌体可以诱导免疫耐受，延长移植物的存活时间，降低淋巴细胞的浸润。通过本课题，明确了外泌体HLA-G诱导同种异体移植物的免疫耐受及其机制，为将外泌体作为诱导免疫耐受的工具应用于器官移植奠定了基础。