基于微流控芯片的数字邻位连接反应单分子蛋白质检测研究

Very low abundance protein molecular detection, especially for early diagnosis of cancer markers detection is extremely difficult, with the development of single-cell omics in the recent years, there is no a better approach for precise quantification of protein molecules within a single cell. This project intends to develop an novel microfluidic digital proximity ligation assay chip for single protein molecule detection, which integrates the proximity ligation assay for protein detection with the self-priming compartmentalization digital PCR chip to develop an absolute quantitative method for single protein molecule counting - digital proximity ligation assay. This method can provide a new tool for single molecule proteins detection of low abundance proteins and absolute quantification of single cell protein molecule detection. With the advantages of high detection sensitivity, strong specificity, low sample consumption, simple operation, testing equipment common and so on, the digital PLA method not only can detect trace amounts of tumor protein markers in the serum with tiny nonspecific detection, and the number of protein molecules in a single cell by single molecule counting. Compared to the existing single molecule enzyme-linked immunoassays detection technology, this method is more simple, less sample consumption, better sensitivity and specificity. For the early diagnosis of cancer, the occurrence and development of tumor, drug screening, single cell analysis and identification of cancer stem cells, digital PLA will have important application value and practical value.

极低丰度的蛋白质分子的检测，特别是癌症早期诊断的标志物的检测极其困难，伴随着近年来单细胞组学的发展的需要，尚无法对单细胞内蛋白质分子进行精确定量。本项目拟研制自主知识产权的单分子蛋白质检测微流控芯片，将邻位连接反应与数字PCR芯片整合在一起，研制一种对蛋白质精确定量的单分子蛋白质检测新方法-数字邻位连接反应，为蛋白质分子的单分子检测及单细胞内蛋白质分子精确定量提供一种新工具，解决低丰度蛋白质精确定量的难题。数字PLA方法具有检测灵敏度高、特异性强、样品消耗低、操作简单、检测设备常见等优点，它不仅能检测血清中的痕量肿瘤标志物蛋白质分子，受干扰度小，而且可以对单细胞内微量的蛋白质分子进行单分子计数，比现有的单分子酶联免疫技术更加简单、样品消耗更少、灵敏度更好、特异性更高，对癌症的早期诊断、肿瘤的发生、发展、药物筛选、单细胞分析及肿瘤干细胞的鉴定等研究具有重要的应用价值和实用价值。

随着数字PCR技术的发展，DNA/RNA检测水平已经达到了单分子水平，并可对单细胞内DNA/RNA进行精确定量，然而蛋白质分子的检测则远远落后于核酸分子的检测。在临床诊断中，检测疾病发生和发展状况，需要在复杂的样品中检测低浓度的蛋白含量，现在典型使用的免疫方法检测蛋白质的浓度检测限为10-12 M。在癌症、神经紊乱以及早期感染中起作用的蛋白在血浆中的浓度大约在10-16到10-12 M。数字ELISA微流控芯片已经被发明用来检测低浓度蛋白，检测限为78 zM。然而数字ELISA方法，操作比较复杂，需要磁珠捕获标记的蛋白分子，而且操作时，需要计算优化磁珠与蛋白分子的结合比例，而且检测的特异性也有待进一步验证，而且对检测仪器的要求也比较高。这些缺点还是不利于单分子蛋白质的快速、准确定量。该研究项目将蛋白质邻位连接反应和数字PCR技术结合在一起，基于自主设计的自吸分液式数字PCR芯片发明了一种最新的单分子蛋白检测方法-数字亲和连接（Digital Proximity Ligation Assay）对单个蛋白分子进行检测，对蛋白表达量进行精确定量。我们建立了高通量自吸分液式数字PLA微流控芯片，反应体积为5.5 nL，可同时检测10个样本或者10个单细胞。通过对已知浓度的EGFR蛋白分子进行检测，最低检测浓度达到了9.125×10-18 M，检测灵敏度可检测单个蛋白分子。与数字ELISA相比，不需要再用磁珠进行蛋白分子的捕获，不需要考虑使用磁珠的比例，通过对阳性反应小室计数就可知蛋白样品的分子拷贝数。在此基础上，建立了对单个细胞内单分子蛋白精确定量的方法，应用该技术对单细胞内的单个蛋白质分子进行了准确定量。该方法以非小细胞肺癌A549细胞系为检测样本，对A549单细胞中的表皮生长因子EGFR进行绝对定量，可检测单细胞内单个EGFR蛋白质分子，得单细胞中EGFR蛋白质的分子拷贝数为2840±82.1个，最低检测限为2 aM。通过对10个单细胞内EGFR蛋白质的分子的精确定量，显示了单细胞之间的异质性。该方法技术具有灵敏度高、准确度高、操作简单、应用范围广等特点，可对单细胞内单个蛋白质分子进行绝对定量，有望建立单细胞内的DNA、RNA和蛋白质表达的关联性，为单细胞基因组、蛋白质组以及疾病诊断、信号转导、肿瘤标志物的发现提供了一种全新的工具。