根瘤菌对铜的应激响应及适应机制研究

Rhizobia with heavy metal resistance have been proposed as important nitrogen-fixing microbes for phytostabilization assistance of heavy metal contaminated soils. However, little is known about metal resistant characterization and mechanisms of rhizobia. In this study, copper resistance mechanisms will be investigated for a copper resistant plant growth promoting rhizobium Mesorhizobium amorphae 186 isolated from nodules of Robinia pseudoacacia growing in mine tailing. The toxicity and physiological responses to copper will be explored using SEM, FCM, LSCM and ICP-MS. Genome-wide transcriptional analyses coupled with differential proteomic data will be used to reveal the differential expression of key functional genes associated with copper resistance, and thereby build up the copper resistant strategies developed by Mesorhizobium strain. The objective of this project is to provide a detailed mechanistic understanding of copper resistance in rhizobia across the toxicity, physiological responses, detoxification, repair and adaptation, which is an important component of its potential as a bioremediation agent in rhizobium-legume symbiosis.

重金属抗性根瘤菌作为一种可被用于植物固定技术的重要固氮微生物，其独特的耐铜机制值得深入研究。本项目拟以铅锌尾矿区刺槐根瘤中分离的铜抗性根瘤菌Mesorhizobium amorphae 186为研究对象，采用扫描电镜、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜、ICP-MS等测试技术，分析铜的毒性效应及根瘤菌对铜胁迫产生的生理响应；在对该菌株全基因组测序的基础上，进一步分析该菌株的转录组学，并结合已获得的差异蛋白组学结果，明确根瘤菌对铜的毒性响应、解毒机制、自我修复途径及适应机制，为深入发掘新的生物耐铜机制、利用根瘤菌-豆科植物共生体系进行铜污染生物修复提供理论依据。

揭示根瘤菌的重金属抗性机制是运用根瘤菌-豆科植物联合修复体系修复重金属污染土壤的基础和前提。本项目以抗铜根瘤菌Mesorhizobium amorphae 186为研究对象，采用转录组与蛋白组相结合的方法，将菌株对铜胁迫的生理响应与多层组学数据进行关联比较和整合分析，构建根瘤菌在不同生境下的解毒途径及铜稳态调控网络, 为深入发掘新的生物耐铜机制、利用根瘤菌-豆科植物共生体系进行污染土壤生物修复提供理论依据。研究所得重要结果如下：1）耐铜根瘤菌对铜胁迫产生的生理响应主要体现为：长期铜胁迫导致根瘤菌细胞膜损伤，细胞膜通透性增强，细胞内还原性巯基浓度显著降低，细胞的抗氧化能力下降；铜胁迫扰乱了细胞内二价Fe和三价Fe的平衡，增加了胞内活性氧簇产生的风险；铜胁迫导致菌株多种细胞功能受损，包括离子运输、核酸代谢、转录、翻译、修复等。2）转录组数据相关性分析表明，与低浓度（0.05 mM）铜长期胁迫相比，高浓度（0.5 mM）铜长期胁迫与瞬时诱导条件下菌株的基因表达情况较为相似。通过基因注释分析鉴定出多种与铜抗性相关的基因，包括：多铜氧化酶（Multicopper oxidase）、金属外排蛋白（RND transporter、Cu P-type ATPase）等。除铜特异性抗性基因外，其他非特异性重金属抗性基因也参与了中慢生根瘤菌的耐铜机制，如锌、铅、镉离子外排相关的基因（Zn/Pb/Cd P-type ATPase）。此外，Fe、Mn离子运输相关基因上调，可能参与了菌体的修复过程。3）差异蛋白组鉴定的差异蛋白主要参与离子运输、能量合成、氨基酸代谢、蛋白质损伤修复、氧化及抗氧化等过程。然而，转录组与蛋白组数据之间的相关性较低，这一结果表明菌体发生了广泛的转录后调控。