TIRAP基因标签SNP的筛选及其与汉族人群急性肺损伤易感性的关联研究

基因变异与急性肺损伤(ALI)的易感性相关。Toll样受体(TLRs)信号传导通路参与炎症介质生成的调控，通路的过渡激活介导了体内炎症介质的过量生成，启动了ALI的发病。我们近期利用Hapmap数据库选择标签SNPs进行研究，发现编码TLRs信号通路关键衔接蛋白的TIRAP基因2个SNPs(其中1个位于3'UTR)与ALI易感性显著相关，但具体机制不明；目前Hapmap数据库尚不完善，需进一步深度测序探寻是否有其它重要功能SNPs存在。本课题拟首先对TIRAP基因5'UTR、启动子、外显子和3'UTR区域进行测序，筛查标签SNPs并在研究样本中进行分型，探寻是否存在其它的与ALI发病相关的功能SNP；然后利用体内外功能研究方法探讨前期发现的位于3'UTR的SNP是否具有调节基因表达的功能，并对研究中可能发现的其它SNPs进行功能验证。本研究将系统阐述TIRAP基因变异与ALI易感的相关性。

完善ALI/ARDS标本库建设，共收集健康对照910例、ICU疾病对照822例和ALI/ARDS患者465例的血液标本和临床信息。采用PCR直接测序的方法对TIRAP基因6个外显子、启动子、5’UTR和3’UTR区域进行测序。发现位于TIRAP基因启动子区域的1个SNP (A/G)与前期研究的rs595209高度连锁。基因分型研究提示该SNP与ALI/ARDS的易感性相关; ALI/ARDS患者携带等位基因A频率明显高于ICU对照和健康对照组。为阐明其影响ALI/ARDS的发病机制，我们进行了功能研究。分离健康志愿者的外周血PBMCs并进行培养，给予LPS刺激后提取PBMCs的RNA和分离细胞培养上清液；测定携带不同基因型的个体TIRAP mRNA和细胞培养上清液TNF-α和IL-6的浓度。发现在不给予LPS刺激的情况下，3种基因型mRNA表达和TNF-α和IL-6的浓度具有显著性差异，携带AA基因型的个体TIRAP mRNA表达和PBMCs上清液TNF-α/IL-6的浓度明显高于携带AG和GG基因型个体；LPS刺激后，携带AA基因型的个体TIRAP mRNA的表达和TNF-α和IL-6的浓度明显高于携带AG和GG基因型的个体。.TLR-NF-κB信号传导通路在ALI/ARDS的发病机制中具有重要的作用，我们选择编码信号通路蛋白的4个关键基因进行研究（IRAK4、IRAK1、MyD88和TRAF6）。利用Beckman分型平台对276例脓毒症对照和272例脓毒症诱导的ALI/ARDS患者进行基因分型，研究发现位于TRAF6基因内含子区域的rs4755453与中国汉族人群ALI/ARDS的易感性显著相关。为阐明rs4755453影响ALI/ARDS的发病机制，我们进行了后续的功能研究。共选择90个携带不同基因型的健康个体，分离外周血PBMCs并进行培养，给予LPS刺激后提取PBMCs RNA和分离细胞培养上清液。发现在不给予LPS刺激和LPS刺激后，携带GG基因型的个体TRAF6 mRNA的表达量和PBMCs上清液TNF-α和IL-6的浓度明显高于携带GC和CC基因型的个体。.本课题通过分子遗传学研究发现TIRAP和TRAF6基因变异与中国汉族人群ALI/ARDS发病的易感性有关，并借助体外的功能研究阐述了基因变异影响个体发病的机制。