蛋白磷酸酶去活化cAMP通路调控白色念珠菌形态转变的机制研究

Candida albicans is a common opportunistic fungal pathogen. The mechanism of hyphal formation has been studied extensively, while that of hyphal to yeast transition is still unknown. The program is based on the growth model of hypal to yeast transition, then the mechanism of protein phosphatases on the deactivation of cAMP-PKA pathway will be studied. The expression levels of hyphal specific genes activated by cAMP pathway are determined and the morphological changes are observed in protein phosphatase-deleted mutants, thereby screening the protein phophatases that deactivate cAMP pathway. Then the effects of protein phosphatase deletion on the phosphorylation statue and subcellular localization of the proteins such as Bcy1, Efg1 and Tpk1 in cAMP pathway are examined. Co-IP and Pull down experiments are applied to confirm the interactions between protein phosphatases and the proteins in cAMP pathway. With the methods of MS (mass spectra anylasis) and phosphorylated site mutation, the exact sites of dephosphorylation and the mechanism of protein phosphatases in dephosphorylating cAMP pathway proteins will be analyzed. Finally the mechanism of protein phosphatases on the deactivation of cAMP pathway will be clarified. This program will unveil the physiological contributions of protein phosphatases in hyphal to yeast transition, and shed new light on the virulence study of Candida albicans.

白色念珠菌是一种常见的机会性致病真菌，其菌丝生成的机制已有充分研究，但其由菌丝形态向酵母形态转变的机制尚不清楚。本项目拟建立这一逆向形态转变的生长模型，研究在此过程中蛋白磷酸酶对cAMP-PKA（环腺苷酸-蛋白激酶A）通路去活化的分子机制。拟构建蛋白磷酸酶缺失菌株，检测cAMP通路所转录的菌丝特异基因的表达并结合表型观察，筛选参与去活化cAMP通路的蛋白磷酸酶；分析蛋白磷酸酶的缺失对cAMP通路关键蛋白（Bcy1、Efg1和Tpk1）磷酸化状态及其亚细胞定位的影响；通过co-IP和Pull down技术，揭示蛋白磷酸酶和cAMP通路蛋白的相互作用；利用质谱和磷酸化位点突变技术，解析蛋白磷酸酶对cAMP通路蛋白去磷酸化的位点和机制，进而阐明蛋白磷酸酶去活化cAMP通路的分子机理。本研究将揭示蛋白磷酸酶在这一逆向形态转变中的生理作用，为白色念珠菌致病机理的研究提供新的思路。

白色念珠菌的菌丝生成的机制已有充分研究，但其由菌丝形态向酵母形态转变的机制尚不清楚。在本项目的支持下，构建了多个蛋白磷酸酶缺失菌株，包括蛋白磷酸酶1基因GLC7可调控缺失突变体、PP2C家族PTC1、PTC2、PTC4基因缺失突变体、PP5家族PPT1基因缺失突变体和PTC2/PPH3双基因缺失突变体。结合表型观察，发现PP2C家族磷酸酶Ptc1参与菌丝形态向酵母形态的转变过程，这暗示Ptc1可能是去活化cAMP通路的关键蛋白磷酸酶。构建cAMP通路蛋白（Bcy1、Efg1和Tpk1）C端连有Myc的菌株，利用Western blot技术分析Ptc1缺失对Bcy1、Efg1和Tpk1磷酸化状态的影响，发现在血清诱导菌丝发生的过程中，Efg1出现了明显了磷酸化过程，而Bcy1和Tpk1的磷酸化状态变化不明显。去除血清4h后，野生型菌株基本上转变为酵母形态生长，同时Efg1出现了去磷酸化的现象，然而对于ptc1Δ菌株，依然呈现较多的菌丝形态细胞，同时Efg1出现更持久的磷酸化状态，这说明Ptc1可能是去磷酸化Efg1的关键蛋白磷酸酶，进而揭示了蛋白磷酸酶Ptc1在去活化cAMP通路并调控细胞由菌丝向酵母形态转变中的关键作用。蛋白磷酸酶5即PP5是一种广泛存在的PPP家族的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，本项目还对Ppt1在白色念珠菌中的作用进行了深入研究。发现Ppt1对于细胞对盐胁迫、细胞壁胁迫和DNA损伤的耐受是必需的，然而在DNA损伤条件下，Ppt1缺失并不影响DNA损伤应答蛋白Rad53和Rfa2的磷酸化水平，这说明Ppt1在白色念珠菌中的功能有别于在动物细胞中的功能。通过本项目的实施，发表SCI论文13 篇，培养以及合作培养研究生8名，本科生3名。