基于Wnt/β-catenin信号通路探讨温阳化浊通络方干预系统性硬化病纤维化的作用机制

Fibrosis is typical pathologic character of systemic sclerosis (SSc), which is related to prognosis and mortality of SSc. Wnt/β-catenin singaling pathway plays a vital role in SSc fibrosis and is important target in treating SSc fibrosis. Previous study indicated that Wenyang Huazhuo Tongluo Recipe (WYHZTLR) based on lung, spleen and kidney-skin correlation theory treated effectively SSc patients. WYHZTLR could intervene in the cell cycle of dermal fibroblasts from SSc lesion to inhibit the proliferation of dermal fibroblasts, and abated expression levels of collagen and TGF-β1 in vitro. The study on regulation of WYHZTLR on Wnt/β-catenin singaling pathway will be carried out. At the dermal fibroblast level and animal model of SSc level we will study the effects of WYHZTLR on phenotypic transformation, migration, apoptosis，ECM synthesis in fibroblasts and key molecule and target gene of Wnt/β-catenin singaling pathway. We will elucidate the action segment and target of WYHZTLR regulating Wnt/β-catenin singaling pathway. In this program, the mechanisms of WYHZTLR intervening in Wnt/β-catenin singaling pathway will be investigated systemically. The results will provide scientific basis for treatment of SSc.

纤维化是系统性硬化病(SSc)的典型病理特征，与SSc 预后和死亡率密切相关。Wnt/β-catenin信号通路在SSc 纤维化过程中起着重要作用，是治疗SSc纤维化的关键靶点。前期研究表明，基于"肺脾肾-皮毛相关理论"组方中药--温阳化浊通络方治疗SSc临床效果显著，并能干预SSc皮损成纤维细胞生长周期而抑制其增殖，降低胶原、TGF-β1表达水平。本研究拟从温阳化浊通络方调控Wnt/β-catenin信号通路的角度出发，在体外皮肤成纤维细胞水平和SSc小鼠模型的整体水平上考察温阳化浊通络方对成纤维细胞表型转化、迁移、凋亡、ECM合成等的影响，以及对Wnt/β-catenin信号通路关键分子及靶基因表达的影响，明确其干预Wnt/β-catenin信号的作用环节和靶点，综合探讨温阳化浊通络方调控Wnt/β-catenin信号通路而发挥抗纤维化的作用机制，为SSc的防治提供科学依据。

系统性硬化病(SSc)是一种典型的自身免疫性疾病，Wnt/β -catenin信号通路在SSc纤维化过程中具有重要作用，是治疗SSc的重要靶点。本项目主要从温阳化浊通络方调控Wnt/β-catenin信号通路的角度出发，通过离体皮肤成纤维细胞实验和整体SSc动物模型实验，采用流式细胞术、免疫共沉淀技术、荧光素酶报告基因技术、EMSA，荧光定量PCR、Western blot等检验技术，观察温阳化浊通络方对皮肤成纤维细胞生物学功能的影响，以及对Wnt/β-catenin信号通路关键分子及靶基因表达的影响，探讨其作用机制。结果表明：（1）温阳化浊通络方能抑制Wnt-1 诱导的正常人皮肤成纤维细胞表型转化和迁移。（2）温阳化浊通络方含药血清能明显抑制SSc皮肤成纤维细胞的增殖活性，降低Cyclin D1 mRNA和蛋白的表，且具有时间依赖性。同时温阳化浊通络方能诱导SSc 皮肤成纤维细胞凋亡，可能与凋亡抑制蛋白survivin mRNA及蛋白表达的降低有关。（3）温阳化浊通络方能明显提高胞浆内 β-catenin蛋白水平，降低胞核β-catenin蛋白水平，进而抑制SSc 皮肤成纤维细胞胞核内β-catenin蛋白集聚。（4）温阳化浊通络方能阻止β-catenin和TCF-4相互作用，抑制β-catenin /TCF转录活性，干预β-catenin/TCF-4复合物与DNA结合的蛋白转录。（5）温阳化浊通络方能降低 SSc 皮肤成纤维细胞 Wnt/β-catenin 信号通路中Wnt-1表达，升高负性调节因子DKK-1、sFRP表达，抑制其靶基因TGF-β2、ET-1 表达。（6）温阳化浊通络方能降低SSc小鼠皮肤Wnt-1、β-catenin关键分子表达，升高负性调节因子DKK-1表达，抑制靶基因Cyclin D1、survivin、CTGF表达。（7）温阳化浊通络方能降低 SSc 小鼠血清Wnt-1、CTGF 、ET-1含量，升高DKK-1含量，对VEGF含量影响不明显。（8）温阳化浊通络方能减少SSc皮肤成纤维细胞胶原等 ECM 合成，改善皮肤组织的病理变化。上述结果提示，温阳化浊通络方能够通过干预Wnt/β-catenin信号通路发挥抗SSc纤维化作用。本研究从基因、分子水平阐明温阳化浊通络方拮抗纤维化的作用机制，为SSc的基础研究和新药开发提供了理论依据。