基于RORC/FOXP3甲基化修饰探讨温阳化浊通络方调控系统性硬化病Th17/Treg平衡的作用机制

Autoimmune abnormality is closely related to the occurrence and development of SSc. Th17/Treg cell imbalance plays an important role in SSc autoimmune disorders and is a key target in the treatment of SSc autoimmune abnormalities. Our previous study indicated that Wenyang Huazhuo Tongluo Recipe (WYHZTLR) based on lung, spleen and kidney-skin correlation theory treated effectively SSc patients, which can improve the imbalance of Th17/Treg cells, and furthermore increase the mRNA expression level of FOXP3 in SSc patients peripheral blood and decrease the mRNA expression level of RORC,DNMT1/3A. The aim of this project was to investigate the effect of WYHZTLR on the balance of Th17/Treg cells via regulating RORC/FOXP3 DNA methylation. At the lymphocyte level and animal model of SSc level we will study the effects of WYHZTLR on the methylation of RORC/FOXP3 and the differentiation, proliferation, immune activation/inhibition of Th17/Treg cells, in order to reveal the meachnism of WYHZTLR improve imbalance of Th17/Treg cells. The systemic studies of anti-autoimmune response by WYHZTLR via improving the Th17/Treg cell imbalance can provide scientific basis for the treatment of SSc.

自身免疫异常与系统性硬化病（SSc）的发生发展密切相关。Th17/Treg细胞失衡在SSc自身免疫功能紊乱中起着重要作用，是治疗SSc自身免疫异常的关键靶点。前期研究表明，温阳化浊通络方治疗 SSc临床效果显著，并能改善SSc患者体内Th17/Treg细胞失衡，增加外周血中FOXP3的mRNA表达水平，降低RORC、DNMT1/3A的mRNA表达水平。本项目拟从温阳化浊通络方通过影响RORC/FOXP3 DNA甲基化修饰从而调控Th17/Treg细胞平衡的角度出发，在体外淋巴细胞水平和SSc小鼠模型的整体水平上考察温阳化浊通络方对RORC/FOXP3甲基化修饰及Th17/Treg细胞分化、增殖、免疫激活/抑制功能等的影响，明确其改善SSc Th17/Treg细胞失衡的作用机制，探讨温阳化浊通络方通过改善Th17/Treg细胞失衡而发挥抗自身免疫反应的作用机制，为SSc的防治提供科学依据。

系统性硬化病(SSc)是一种以皮肤和内脏器官纤维化为主要特征的自身免疫性疾病，除皮肤外受累器官还包括消化道、肺脏、心脏及肾脏等，其发病机制集中在血管病变、免疫炎症及纤维化3个方面，免疫功能紊乱可能是SSc的重要致病因素。Th17/Treg失衡导致的自身免疫异常在SSc发展中起着关键作用。表观遗传学修饰异常，特别是FOXP3/RORC甲基化是SSc患者Th17/Treg细胞失衡的主要原因。本项目主要从温阳化浊通络方调控SSc Th17/Treg淋巴细胞的RORC/FOXP3 DNA甲基化的角度出发，在分离的SSc患者外周血Th17/Treg细胞和SSc模型小鼠中，采用CCK8、荧光定量PCR、流式细胞术、荧光素酶报告基因技术、Western blot、甲基化特异性PCR、MassArray甲基化检测等技术，观察温阳化浊通络方对Th17/Treg细胞增殖的作用，以及对RORC/FOXP3甲基化修饰相关分子的影响，探讨其作用机制。结果表明，在分离的人外周血Th17/Treg细胞中，SSc Th17/Treg细胞IL-17、RORγt、DNMT1、DNMT3A及DNMT3B上调表达，IL-10、FOXP3等下调表达，FOXP3甲基化增强。在人外周血Th17/Treg细胞和SSc小鼠模型中，温阳化浊通络方均具有：（1）抑制Th17细胞增殖、Th17细胞中IL-17、RORγt表达，促进Treg细胞增殖、Treg细胞中IL-10、FOXP3表达的作用；（2）抑制DNMT1、DNMT3A及DNMT3B蛋白和mRNA表达；（3）促进RORγt甲基化，抑制FOXP3启动子及TSDR甲基化。在SSc模型小鼠中，温阳化浊通络方可改善皮肤和肺病理及纤维化水平，减轻肺部炎症。上述结果提示，温阳化浊通络方能够通过干预RORC/FOXP3 DNA甲基化发挥调节Th17/Treg平衡的作用。本研究从细胞、整体水平阐明温阳化浊通络方调节SSc免疫失衡的作用机制，为SSc的理论研究及疾病防治提供科学支撑。