堆肥菌株Aspergillus fumigatus Z5纤维素酶转录限制因子creA基因的克隆及其功能研究

Hydrolysis of cellulose is one of the most important steps in composting and cellulose industry, which is finished by cellulases. The enzymes are actually the general term of a series of enzymes responsible for the cellulose degradation process and they are endoglucanases (EGs), cellobiohydrolases (CBHs) and β-glucosidases. All of these enzymes worked synergistically to degrade the cellulose fractions. Many studies have shown that most of the cellulases are inducible, and their expression and regulation mechanism has not yet been understood. Currently, the repression effect of the degradated products is an approved regulatory mechanism, and this effect is mediated by the encoded product of gene creA in filamentous fungi. In this study, the creA gene of Aspergillus fumigatus Z5 will be cloned by high-Tail PCR based on the degenerate primers, and the site-directed mutation will be carried out by using the binary vector pDHt/SK, and the derepressed effect mutant Z5-M will be obtained. The SDS-PAGE and 2D analysis methods will be used to value the derepressed effect under the degradation repressing condition, and these results will provide important theoretical basis to clarify the effect of creA gene on the expression and regulation of cellulase. The application of the derepressed effect mutant Z5-M in the treatment of agricultural wastes will be of great significance to improve the composting efficiency and production of bio-ethanol.

纤维素的分解是堆肥过程或纤维素工业利用中最重要的步骤之一，其过程主要由微生物分泌的纤维素酶来完成。纤维素酶是指能够水解纤维素及其衍生物的一系列酶的总称，主要包括葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶,其表达和调控的机理尚未有完全统一的定论。目前降解物阻遏效应是一种比较认可的调控机制，在丝状真菌中这种效应是由调控基因creA所编码的产物介导的。本研究通过设计简并引物并结合highTail-PCR的方法获得高效纤维素分解菌A.fumigatus Z5的creA基因；利用双元质粒pDHt/SK定点突变creA基因，获得去阻遏效应突变体Z5-M。利用蛋白组学方法分析突变体在降解物阻遏条件下的去阻遏效应,为阐明creA基因在纤维素酶表达和调控中的作用提供重要理论依据；通过去降解物阻遏效应的突变体在农业有机废弃物资源化利用中的应用，对加快堆肥速率或提高生物酒精的产量具有重要的理论和实践意义。

分别以葡萄糖、结晶纤维以及稻草粉为唯一碳源诱导菌株Z5进行液体产酶，并测定了纤维素酶、半纤维素酶活力。结果表明，以稻草秸秆粉为唯一碳源诱导条件下，内切葡聚糖酶活力第四天达到最大值（12.17 U•ml-1）外切葡聚糖酶活力不断的升高，并在结束培养时达到最大值（0.58 U•ml-1）；β-葡萄糖苷酶酶活力第四天达到了最大值（2.49 U•ml-1）、木聚糖酶活力二天后达到最大值（181.87 U•ml-1）、海带多糖酶活力两天后达到最大值（2.37 U•ml-1）、地衣多糖酶活力三天后达到最大值（12.78 U•ml-1）；利用iTRAQ技术鉴定并定量出了54个蛋白，根据其功能的不同将其分成了不同的类型，其中纤维素酶占21%、半纤维素酶占8%、糖苷水解酶占11%、几丁质酶占5%、木质素酶类占2%、磷酸酯酶占3%、转运蛋白占3%，蛋白酶占5%、淀粉酶占2%、脂肪酶占2%、果胶酶占2%、氧化还原酶占6%，域蛋白占3%、其他类占13%、而未知蛋白占了14%。这些鉴定的蛋白的理论分子量分布在180-10kDa之间，但是大部分蛋白的分子量主要聚集在80-20kDa；鉴定蛋白的预测等电点分布在4.5-9.5之间，而pI 4.5-6.5之间的蛋白数量居多。利用high-Tail PCR的方法，获得了菌株Z5完整的creA基因，利用生物学软件和在线分析系统，分析了creA基因的基本特征，结果表明已经成功克隆到该基因，信号肽预测结果表明该基因不含信号肽序列，其主要在细胞核内行使功能。利用酵母表达系统，成功将creA基因进行了表达，SDS-PAGE分析结果表明CREA蛋白为70Ka，比理论预测值要大，质谱鉴定结果表明，表达的CREA蛋白是目的蛋白，并为研究CREA调控纤维素酶基因的转录提供基础。利用双元质粒pDHt/SK 定点突变creA基因，获得去阻遏效应突变体Z5-M，通过去降解物阻遏效应的突变体在农业有机废弃物资源化利用中的应用，对加快堆肥速率具有重要的理论和实践意义，但由于实验技术的限制，利用ATMT技术转化很难保证转化子的遗传稳定性，遗传稳定的creA突变子目前还没有成功获得，而新兴技术CRISPR/Cas9出现后，在斑马鱼、酵母、水稻等多种模式生物中得到了有效的利用，其转化效率高、遗传稳定、可同时编辑多个基因，本项目组将继续为该项目未完成的任务继续努力。