蒙古冰草DREB类转录因子基因的克隆及功能研究

DREB是转录调控录因子，参与植物的抗逆、抗病响应。近年来，DREB类转录因子用于改良植物对生物、非生物胁迫耐受性的研究受到普遍关注。蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng），2n=14，是旱生－沙生草原种，常见于干草原和荒漠草原的典型沙质环境中，是国家二级珍稀濒危植物和急需保护的农作物野生近缘种。我们前期研究揭示了蒙古冰草LEA基因的抗旱作用机理，本项目拟从植物对非生物胁迫应答系统的上游元件-转录因子入手，继续研究蒙古冰草的抗逆机制。本研究将利用同源序列方法克隆蒙古冰草DREB基因，分析DREB基因启动子区、编码区和终止子区的序列特征；研究DREB基因在非生物逆境中的表达模式；利用瞬间表达和转基因方法，揭示DREB对蒙古冰草抗逆性的调控机制。为今后蒙古冰草抗逆性研究提供理论依据，同时为这一优良饲草的保护及开发利用奠定科学基础。

蒙古冰草（Agropyron Mongolicum Keng）是防风固沙和草场退化恢复的重要牧草，不仅具有耐寒、耐旱等优异特性，而且含有多种优良的抗性基因，是其他近缘植物抗性改良可资利用的基因库。DREB是转录调控因子，参与植物的抗逆、抗病响应。近年来，DREB类转录因子用于改良植物对生物、非生物胁迫耐受性的研究受到普遍关注。本项目以蒙古冰草为材料，分离转录因子DREB基因，获得序列信息；分析该基因在非生物逆境条件下的表达调控模式；并对蒙古冰草DREB基因的功能进行了验证。主要结果如下：.1.利用同源序列法从蒙古冰草中克隆得到1个DREB3类转录因子基因，命名为MwDREB3（No.KC747717），基因全长1056bp,包含1个完整的开放阅读框，长度为774bp，编码257个氨基酸，预测蛋白分子量为27.74KD，等电点为4.18，该蛋白近5＇端含有1个保守的AP2结构域。系统进化树分析表明MwDREB3编码的蛋白与小麦的DREB、山羊草DRF1的进化关系较近。 .2. 采用实时定量RT-PCR技术分析了MwDREB3基因的在干旱、高盐、低温和ABA诱导条件下的表达模式，结果显示该基因受干旱、高盐、ABA诱导表达。低温处理条件下，MwDREB3基因的表达量下调。.3. 以蒙古冰草营养体为外植体建立了高效的蒙古冰草再生体系。以茎尖为最适宜的外植体进行愈伤诱导，MS+2,4-D 1.5mg/L+6-BA 0.1mg/L培养基愈伤组织诱导率最高，达到84.9%，并且愈伤状态良好。以MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L培养基分化率最高，为53.2%。生根培养基 MS+NAA 0.5mg/L，生根率为100%。.4. 成功构建了蒙古冰草DREB的植物表达载体PCAMBIA2300- MwDREB3。利用根癌农杆菌介导法将该基因转入烟草中，获得转基因植物。.5 转基因验证结果表明：干旱胁迫下转基因烟草叶片的萎蔫程度明显低于野生型烟草，复水后转基因烟草叶片的膨压恢复也较好。相对电导率低于对照，超氧化物歧化酶活性及游离脯氨酸含量均高于对照。MwDREB3基因在烟草中过量表达提高了烟草抗旱能力，并发现转基因烟草植株的高度明显降低于同期野生型对照，生长迟缓、植株矮化。由此认为该基因在草坪草抗旱性改良研究中具有较大的利用价值。