低温胁迫下凡纳滨对虾GRP78调控内质网稳态的分子机制

Previous study showed that the expression of GRP78 was up-regulated during cold stress in Litopenaeus vannamei.GRP78 is the central regulator of ER stress, however the molecular mechanism of endoplasmic reticulum homeostasis is unclear. On the basis of the previous study of proteomics, the molecular mechanism of endoplasmic reticulum homeostasis regulated by GRP78 during cold stress in Litopenaeus vannamei will be explored. Cell biology and molecular biology methods will be used in this research. First, the endoplasmic reticulum stress related genes will be cloned and the expression will be analyzed; then the haemocytes detection in vitro and in vivo will be used to analyze the expression of genes related to endoplasmic reticulum stress pathway and apoptosis pathway during cold stress; on the above basis, RNA interference will be used to suppress the expression of GRP78, and the morphology, injury, apoptosis of haemocytes and gene expression will be investigated. The stress response strategy of Litopenaeus vannamei will be explored in this study, and it has important practical significance in the healthy aquaculture of shrimp. Furthermore it will provide a new theory to the molecular mechanism of the crustacean defense environmental stress.

前期研究表明，低温胁迫诱导凡纳滨对虾GRP78表达上调，GRP78是内质网应激的中心调控因子，其如何调控内质网稳态的分子机制尚未清楚。在前期差异蛋白质组学研究基础上，拟进一步探讨GRP78调控内质网稳态的分子机制。本项目采用细胞生物学与分子生物学相结合的手段开展研究。首先对内质网应激相关基因进行克隆并分析表达谱；继而采取血细胞体外培养与活体检测相结合的手段，分析低温胁迫下GRP78与内质网应激信号通路及其介导的细胞凋亡途径相关基因的表达；在此基础上利用RNA干扰抑制GRP78表达，综合探讨血细胞形态、损伤、凋亡及基因表达调控的关系。该研究深入探索凡纳滨对虾响应低温胁迫的应激反应策略，对虾类的健康养殖具有重要的现实意义，并为深入研究甲壳动物防御环境胁迫的分子机理奠定理论基础。

低温胁迫诱导凡纳滨对虾GRP78表达上调，GRP78是内质网应激的中心调控因子，其调控内质网稳态的分子机制尚未清楚。本项目采用分子生物学与多组学相结合的手段开展研究。首先对内质网应激相关基因进行克隆并分析表达谱；继而采取在体检测的手段，分析急性低温胁迫与模拟自然降温条件下GRP78与内质网应激信号通路及其介导的细胞凋亡途径相关基因的表达；在此基础上利用RNA干扰抑制GRP78表达，探讨了血细胞形态、损伤、凋亡及基因表达调控的关系。同时利用组织学手段与多组学技术分析了肝胰腺与肠道响应温度变化的关键调控通路。研究结果表明三条UPR通路均参与温度变化过程，并且在肝胰腺中的反应比在血淋巴中的反应迅速。在物质代谢方面，凡纳滨对虾主要依靠调动蛋白和脂肪来抵御胁迫；机体损伤方面，在急性低温应激中虾体受到严重损失，而在慢性降温再回温处理中虾体能够进行自我调节恢复；多组学分析方面，miroRNA分析表明氧化还原酶活性（GO：0016491）是低温应激后最显著的分子功能，转录组分析表明内质网蛋白质加工（ko04141）最显著富集的通路，转录组和microRNA数据联合分析表明内质网在适应或对抗低温应激方面发挥重要作用，蛋白质组学数据表明精氨酸激酶、热休克蛋白和组蛋白可作为对虾温度变化过程中的阳性调节因子。另外，hippo信号通路可能有助于对虾肠道的组织修复。温度波动会降低肠道的病原识别及抗菌能力，造成氧化应激。同时，对虾可能通过提高粘蛋白和抗凋亡相关基因（p53和IAP）的表量量来维持肠道稳态。这些数据对凡纳滨对虾的健康养殖具有重要的现实意义，为对虾抗逆基因的筛选打下坚实的理论基础，并为对虾抗逆育种提供理论参考。