可降解温度敏感性水凝胶构建血管紧张素转换酶shRNA真核表达载体基因沉默作用的实验研究

作为一种新型医用高分子材料，温度敏感性水凝胶能替代心肌梗死后受损的细胞外基质，改善梗死区局部微环境，在心肌梗死动物模型的应用中取得了较好的治疗效果。RNA干扰技术因其引致的特定靶向基因沉默效应，越来越被广泛应用于基础及临床研究的各个领域。但现有研究表明，RNA干扰技术能否有效应用于临床医疗实践，除了取决于其基因沉默的有效作用时间，还取决于或部分取决于小干扰RAN片段能否安全有效的导入细胞从而达到靶向基因沉默效应。本研究以新型可降解温度敏感性水凝胶为载体，构建水凝胶/血管紧张素转换酶基因真核表达载体，利用RNA干扰技术，达到转录后的血管紧张素转换酶基因沉默效应，验证修饰后的温度敏感性水凝胶可作为基因转染的有效载体，实现更加优越的基因沉默效应及安全性。应用于心肌梗死动物模型，实现比心脏局部单纯应用血管紧张素转换酶抑制剂/温度敏感性水凝胶共聚体而更加优越的心梗后心脏保护作用。

从生物可降解的材料中持续释放质粒DNA（plasmid DNA，pDNA）能延长外源基因的表达时间和提高其表达水平。葡聚糖-聚己内酯－甲基丙烯酸羟乙酯共聚N-异丙基丙烯酰胺(Dextran-poly(e-caprolactone)-hydroxylethyl methacrylate /poly( N-isopropylacrylamide)，Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm)水凝胶是一种人工合成的生物可降解的温度敏感性生物材料。我们已经证实注射这种水凝胶能改善心肌梗死后的心脏重构。RNAi是一种基因沉默的新技术，能减少对疾病恢复不利的基因表达，从而可用于疾病的治疗。我们将H9C2心肌细胞培养在不同浓度成胶后的Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm水凝胶（1.0 wt%, 1.5 wt% 或3.0 wt%）与pDNA混合物表面，然后在细胞培养箱中培养，结果发现，与一般的转染方法相比，生长在成胶后pDNA与这些水凝胶混合物表面上的H9C2心肌细胞存活率较高(P<0.05)。在转染7d和14d后生长在质粒与1.5 wt%水凝胶混合物表面上的H9C2心肌细胞转染效率最高(P<0.05)。此外，我们还发现血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme, ACE)-shRNA质粒负载的Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm水凝胶注射到大鼠心脏后能延长外源基因表达时间和增强基因表达效果。在大鼠心肌梗死后，在心肌内直接注射ACE-shRNA质粒负载的Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm水凝胶能降低心脏内ACE的表达，并能比单独注射ACE-shRNA质粒或水凝胶取得更好的心脏保护作用。而且，心肌内直接注射ACE-shRNA质粒负载的Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm水凝胶比注射水凝胶包裹的ACE抑制剂对心肌梗死大鼠具有更好的心脏保护作用。本研究以新型可降解温度敏感性水凝胶为载体，利用RNAi技术，达到转录后的ACE基因沉默效应，这为临床治疗此类疾病提供了新思路。