莲子草假隔链格孢T-DNA插入突变体库的构建及产孢相关基因的克隆

空心莲子草是被国家环保部列入"中国第一批外来入侵物种名单"的重要恶性外来入侵杂草。申请者所在项目组经过数年研究，成功筛选出对空心莲子草具有很好控制效果的莲子草假隔链格孢（Nimbya alternantherae），但是该生防菌产孢条件苛刻是影响其成功应用的限制因子,同时还发现该菌株具有不同于其它生防真菌的产孢特性。本项目拟通过农杆菌介导转化构建莲子草假隔链格孢的T-DNA标记插入突变体库，筛选出产孢缺陷型突变体；利用TAIL-PCR、RT-PCR等技术克隆该生防菌产孢相关基因cDNA全长，通过Southern、Northern杂交验证相关基因的拷贝数及其在野生型菌株中的表达；结合基因互补技术验证相关功能基因与产孢的关系。本项目的研究结果可揭示莲子草假隔链格孢分生孢子形成的分子机理，丰富有益真菌孢子形成基本规律的科学内容，为生防菌假隔链格孢规模化生产或设计新的仿生产品提供可靠的理论依据。

空心莲子草(Alternanthera philoxeroides Griseb)是在我国分布广泛且水陆两生的外来入侵恶性杂草。莲子草假隔链格孢（Nimbya alternantherae）被普遍认为是空心莲子草潜在的生防菌。然而，有关莲子草假隔链格孢的遗传转化尚未有报道，严重制约了该生防菌产孢和致病相关基因的挖掘和利用。我们利用农杆菌介导转化技术，对莲子草假隔链格孢的遗传转化和产孢相关基因进行了研究，构建了莲子草假隔链格孢SF-193菌株的突变体库，该生防菌的最佳遗传转化条件为分生孢子浓度105个•mL-1、乙酰丁香酮浓度为100µg•mL-1、共培养温度为22.5℃、农杆菌OD600为0.24下共培养时间48h，每平板的转化子数可达到28个左右。在该遗传转化条件下，共获得遗传稳定转化子1830个。对13个转化子进行了PCR和Southern blot鉴定，结果表明，从转化子全基因组DNA中PCR扩增获得了约1.4kb大小的潮霉素抗性基因，野生型菌株未出现扩增条带。Southern blot结果显示，8个转化子中T-DNA以单拷贝的方式随机整合到SF-193基因组DNA中。分析比较了野生型菌株与转化子的产孢和致病性，筛选获得了一株产孢量比野生型菌株下降6.4倍的转化子Nal1，未筛选到致病性显著下降的转化子。对转化子Nal1进行了研究，Southern blot结果显示其T-DNA的插入为单拷贝，以野生型菌株SF-193和转化子Nal1的DNA为模板，利用Tail-PCR扩增相关基因，挑取获得了12个克隆，测序结果未找到与产孢有关的基因片段。本研究未获得产孢相关基因，但建立了莲子草假隔链格孢的遗传转化体系，为深入挖掘产孢和致病相关基因奠定了基础，为进一步研究莲子草假隔链格孢分生孢子形成的分子机理提供了可靠依据。