以肝星状细胞为靶点的N1-乙酰基取代吡咯烷化合物A5抗肝纤维化作用研究

N1-乙酰基取代吡咯烷化合物A5是在国家基金重点和"863""以基质金属蛋白酶为靶点的药物设计"等课题实施过程中筛选发现的一个具有很强上调节肝星状细胞表达MMPs并抑制炎性因子对该细胞激活的全新结构化合物。以体外培养人TWNT-4和大鼠HSCs-T6为靶细胞,观察该化合物对肝星状细胞活化的抑制作用；以Annexin V等法检测A5对活化状态肝星状细胞的凋亡作用；以CCL4和DMNA法建立大鼠肝纤维化模型，评价该化合物体内抗肝纤维化功能；以Western blot, PCR等研究A5对肝纤维化过程中一些关键信号蛋白的抑制或调节作用，包括对肝星状细胞激活的抑制作用，对MMPs/TIMPs调节作用及炎性因子产生的抑制作用。研究A5对肝星状细胞激活过程中TGF-β1/Smad2,3/CTGF信号的阻滞作用，对PDGF/PI3K及Fas,TNF-α和NGF的调节功能，以探讨A5抗肝纤维化作用机制。

按照计划完成，采用1.明胶酶活性筛选实验：以琥珀酰明胶降解法检测化合物CIP-A5和CIP-A3对Ⅳ型胶原酶活性抑制作用；以SDS-PAGE明胶酶谱分析HSC-T6细胞上清MMP-2、MMP-9水平，评价化合物对酶活性影响。筛选出了化合物CIP-A5活性明显高于化合物CIP-A3，该化合物成为进一步研究的候选化合物。2.化合物CIP-A5和CIP-A3对大鼠肝星状细胞增殖与凋亡影响：研究CIP-A5抗肝纤维化作用，采用流式细胞术观察其诱导HSC-T6细胞凋亡影响。3.化合物CIP-A5和CIP-A3对大鼠肝星状细胞相关纤维化细胞因子表达水平影响：以免疫印迹法检测CIP-A5和CIP-A3对活化肝星状细胞HSC-T6中MMP-2、MMP-9及相关纤维化因子TGF-β、TNF-α、CTGF表达水平，评估CIP-A5和CIP-A3抗肝纤维化作用。4.CIP-A5对于小鼠肝纤维化模型的抑制作用观察。结果发现：CIP-A5浓度在5-30ng/ml，与明胶酶孵育30min，明胶酶激活从28.4%增加到126.7%；与HSC-T6细胞接触24h后，CIP-A5（1-100μg/ml）对培养上清中mmp-2活性由38.6%提高至190.5%，mmp-9活性由22.4%增加至170.0%；在与TGF-β共同孵育后，CIP-A5对培养上清中mmp-2的活性由30.0%增加至169.5%，mmp-9活性由21.4%增加至170.0%；以Western blotting分析发现该化合物对活化mmp-2的表达量由50%提高到160.8%，mmp-9的表达量也由30.0%增加至109.5%；CIP-A5（1-100μg/ml）经过72h孵育，TIMP-1的表达抑制率分别为10.6%，32.8%, 51.7%, 67.3%及79.5%；在与CIP-A5(1-100 μg/ml)共同孵育72h后，TGF-β与TNF-α的表达呈剂量依赖性降低，其中TGF-β的表达抑制率从15.7%增加至50%；TNF-α抑制率从32.8%增加至160%；CTGF抑制率分别为15.3%,26.8%, 41.5%, 68.6% and 79.1%。实验筛选出了CIP-A5进行动物实验，发现具有明显抑制小鼠肝纤维化模型形成。本课题累计发表署名本项目编号资助SCI收录文章4篇，培养博士生1名，硕士生2名。