TET2维持神经元存活新功能及不依赖加氧酶活性的作用机制研究

Neuronal survival is essential for the maintenance of normal brain function. Newly discovered DNA dioxygenases TET2 (ten-eleven translocation 2) is highly expressed in the central nervous system, especially in neurons. Our recent in vitro study further found that, down-regulation of primary neuronal distributed TET2 resulted in a significant increase of cell mortality. Previous studies suggest that TET family regulate development-related genes expression through conversing 5-methylcytosine (5mC) to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) of DNA with their conservative C-terminal catalytic domain (CD). However, in our experiment, exogenous supplement of CD fusion protein could not rescue these neurons. Therefore, we hypothesize that there exists a novel domain in TET2 to maintain the neuronal survival independent of CD. This project aims to : 1 ) further clarify that TET2 maintains neuronal survival under both physiological and pathological conditions using RNA interference and neuronal injury model; 2 ) map the pivotal regions responsible for the specific survival function of TET2 with a series of deletions; 3 ) seek the molecules interacted with TET2 using GST pull down, and then explore TET2 mediated signaling pathways. This project will reveal the novel function of dioxygenase TET2 to sustain neuronal survival, and clarify the underling mechanisms.

神经元存活对于维持正常脑功能至关重要。新发现DNA修饰酶TET2（ten-eleven translocation 2）蛋白在神经元中表达丰富。预实验进一步显示，下调TET2后神经元死亡率显著增加，提示TET2可能具有调控神经元存活的新功能。以往TET的机制研究都是立足于其保守的加氧酶活性结构域（catalytic domain，CD）调控基因表达。而预实验中下调TET2的同时，及时补充TET2-CD蛋白却不能挽救神经元。因此推测，TET2存在CD以外的维持神经元存活的新结构域。本项目拟从以下三方面研究：1）利用RNA干扰技术和神经元损伤模型进一步明确生理及病理条件下TET2维持神经元存活的功能；2）利用截断体实验和蛋白转导技术鉴定TET2维持神经元存活的关键结构域；3）寻找TET2的相互作用蛋白，探索分子机制。本研究将揭示神经元中TET2维持细胞存活新功能和不依赖CD结构域的新机制。

神经元的存活是研究神经发育、退变及再生中的基本问题之一。文献报道，DNA双加氧酶TET（ten-eleven translocation）高表达于中枢神经系统，通过其羧基段的CD结构域催化5hmC生成进而调控神经发育。基因敲除实验显示，缺失全长TET2的小鼠大量的死亡，而只缺失CD段的小鼠正常存活。预实验结果显示，下调TET2后神经元死亡率显著增加，而给予外源的CD段融合蛋白并不能挽救神经元。因此，我们推测TET2蛋白中存在CD段以外的具有维持神经元存活的新结构域。本项目首先利用RNA干扰技术明确，下调原代神经元中TET2后，神经元存活率下降。在脑缺血再灌注、老年痴呆症、氧化应激等神经元病理损伤模型中，TET2表达下调。揭示了TET2在生理病理条件下均具有维持神经元存活的新功能。进一步根据结构分析，将TET2氨基段从626aa位点截断为两段，表达纯化TAT-TET2(1-626aa)和TAT-TET2(627-1167aa)融合蛋白,TAT为穿膜肽。TET2 shRNA慢病毒感染神经元的同时，分别补充上述两种蛋白。结果显示，TAT-TET2(1-626aa)处理组能够部分逆转慢病毒下调TET2后神经元的死亡，而TAT-TET2(627-1167aa)处理组无明显效应。揭示了TET2氨基段维持神经元存活的关键结构域位于1-626aa区段。最后，利用神经元氧化应激模型，给予TAT-TET2(1-626aa)预处理，能够显著上调Bcl-2表达，下调Caspase-3表达。阐明了TET2氨基段通过Caspase-3和Bcl-2信号分子，维持神经元存活。本项目结果揭示，TET2具有维持生理病理条件下神经元存活的新功能，同时为研究TET蛋白氨基段的功能开辟了新的方向。