铜绿微囊藻对虾类致死效应的细胞免疫毒理作用

铜绿微囊藻是蓝藻水华中最常见的一种藻类，其产生的微囊藻毒素对多种水生动物有致死作用。申请人前期研究结果表明，暴露于一定浓度铜绿微囊藻的克氏原螯虾和罗氏沼虾幼虾存活率显著降低，肝胰腺颜色及超微结构有明显变化；文献证实，虾池中铜绿微囊藻等蓝藻形成优势种与虾病暴发呈正相关；而在生产中，养殖中后期的虾池，也经常爆发蓝藻水华，导致虾类原因不明的死亡。铜绿微囊藻是如何导致虾类死亡？对这些虾的染毒途径怎样？对虾类的免疫系统又会产生怎样的危害？本项目拟采用HPLC/MS/MS、TUNEL、流式细胞术、电子显微镜、总血细胞计数、血细胞吞噬表达绿色荧光的大肠杆菌、酶学和细胞化学等技术和方法，系统研究铜绿微囊藻及微囊藻毒素对虾类血淋巴细胞和肝胰腺的氧化物胁迫、细胞吞噬能力、总血淋巴细胞数量、细胞酶学和细胞化学、细胞超微结构和细胞凋亡等各个免疫相关指标的变化，全面评价微囊藻的免疫毒理效应，试图回答上述科学问题。

铜绿微囊藻爆发可产生微囊藻毒素，影响包括虾类在内的多种水生生物的生长和存活。项目构建了固相萃取进行样品前处理、超高效液相色谱质谱联用技术(UPLC/MS/ MS) 高效、准确检测微囊藻毒素在多种生物体内累积的的方法，检测时间缩短到4.5-4.8分钟; 检测限LOD和定量限LOQ分别为0.0075 μg/g和0.01575μg/g，回收率在98.4%～103.4%之间；证实了微囊藻毒素可以直接或间接的在罗氏沼虾消化道、鳃和肝胰腺中快速积累，2h后，即可在鳃、消化道和肝胰腺中检测到微囊藻毒素；24h内，肝胰腺中微囊藻毒素累积量为0.49±0.04 μg g-1干重；而在肌肉和血液中较少累积。铜绿微囊藻对克氏原螯虾的毒性试验表明，暴露于一定浓度的铜绿微囊藻液中的幼虾存活率显著下降，肝胰腺肿大，肝胰腺细胞受损；成虾总血细胞数量显著升高，血液吞噬指数显著降低，SOD、POD、PO等免疫学指标受到影响。通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术检测发现，MC-LR可能通过直接或间接的方式影响对虾3 种抗菌肽基因的表达，对免疫系统造成损伤，致使对虾抗病能力减弱。而对凡纳滨对虾免疫相关基因表达谱进行分析，细胞粘附和吞噬作用在抵御微囊藻毒素毒害过程中发挥了重要作用。