基因编辑生物制剂的构建及其对乳腺癌干细胞逆分化研究

Breast cancer stem cells are not sensitive to chemotherapeutic agents, and they are the major factors that lead to recurrence of breast cancer. Here, we propose a reverse differentiation strategy that edits key stem genes of the cells, resulting in a reverse differentiation to “normal” somatic cells. How to edit the genes and to differentiate breast cancer stem cells reversely remain to be important scientific issues. The objectives of the study are to edit the key genes of breast cancer stem cells by constructing biological formulations for creating "normal" somatic cells through a reverse differentiation, and to reveal its mechanism and function. CRISPR/Cas9/CSC gene editing formulations are constructed to edit the key gene NANOG and SOX2 for creating the reverse differentiation. The studies are performed on breast cancer stem cells, including the culture and identification of breast cancer stem cells, the construction and characterization of CRISPR/Cas9/CSC gene editing formulations, the studies on gene editing and reverse differentiation, and the functional verification in animals. The present study would obtain "normal" somatic cells with new genotype and phenotype, and reveal the mechanisms of gene editing and reverse differentiation, hence providing a basis for new or "subversive" treatment strategy of breast cancer. The study has an important scientific value and a clinical significance.

科学问题：乳腺癌干细胞对化疗药不敏感，是导致乳腺癌复发的主要因素之一。我们提出对乳腺癌干细胞逆向分化策略，对乳腺癌干细胞关键干性基因进行编辑，致其逆向分化为正常体细胞。如何对乳腺癌干细胞进行编辑修饰、阐明其机制是亟待解决的关键科学问题。研究目标：构建基因编辑生物制剂，对乳腺癌干细胞关键基因进行编辑，创建出逆向分化的 “正常”体细胞，揭示其机制和功能。研究内容：以乳腺癌干细胞为对象，构建CRISPR/Cas9/CSC基因制剂，对其干性基因NANOG、SOX2等进行编辑和逆向分化研究。主要包括（1）乳腺癌干细胞培养与鉴定；（2）乳腺癌干细胞基因编辑生物制剂的构建与表征；（3）基因编辑与逆向分化研究；（4）动物体内功能验证。预期结果：获得新基因型 “正常”体细胞并揭示调控机制，为乳腺癌“颠覆性”的根治策略提供依据，研究具有重要的科学价值和临床意义。

研究背景：乳腺癌的复发转移与乳腺癌干细胞的低化疗响应性、无限制增殖复制潜能有关，调控乳腺癌细胞/乳腺癌干细胞的关键基因，实现其逆向分化，可望防止乳腺癌复发转移。研究目标：构建基因编辑生物制剂，对乳腺癌细胞/乳腺癌干细胞的关键基因进行编辑调控，实现其逆向分化，抑制癌细胞的恶性增殖，并揭示相关机制。主要内容：（1）基因编辑生物制剂的构建与表征；（2）基因编辑与逆向分化研究；（3）体外细胞与动物体内功能验证；（4）相关机制探究。重要结果：构建靶向乳腺癌细胞/乳腺癌干细胞关键基因的特异性基因编辑生物制剂，以乳腺癌细胞、乳腺癌干细胞以及荷瘤动物为主要研究对象，验证提出的乳腺癌逆向分化治疗策略。其中，αEmyc基因编辑制剂可特异性“删除”雌激素受体阳性乳腺癌c-Myc基因的新生增强子αEmyc，阻断αEmyc关键位点half-ERE与转录因子ERα结合，诱导逆向分化，并有效抑制乳腺癌生长发展；靶向性pHR-pCas9基因编辑纳米粒可精准插入并稳定表达乳腺癌转录因子CTCF，创建转分化的新基因型与表型“正常”体细胞，并通过CTCF上调-STOM下调分子机制抑制乳腺癌生长转移；Twist1基因编辑制剂可特异性敲除三阴性乳腺癌转录因子Twist1基因，诱导逆向分化，并通过下调PI3K/AKT信号通路的关键信号分子抑制乳腺癌生长转移。科学意义：项目提出了基于基因编辑技术的乳腺癌逆向分化治疗策略，为发展癌症变革性治疗新策略和研发新型治疗药物奠定了理论基础、提供了实验证据，具有重要的科学意义和潜在的临床应用价值。