长爪沙鼠Willis环变异缺失与微卫星多态性及相关基因研究

脑血管畸形是脑血管病发生的高危因素。以往的研究表明长爪沙鼠脑底动脉Willis环存在多种变异缺失类型，我们前期研究发现Willis环的变异缺失类型有明显的遗传性，并与某些微卫星位点呈相关性。因此我们推断决定Willis环变异缺失的基因改变引起了连锁微卫星位点的多态性发生，通过这些位点可以找到相关基因。本研究拟通过已筛选出的微卫星位点对Willis环变异缺失不同表型的长爪沙鼠基因组进行相关性分析，筛出与Willis环相关的微卫星位点。以这些位点为探针，对基因组文库进行杂交，应用生物信息学方法对阳性克隆的序列与已知的脑血管畸形相关基因进行同源性分析；同时采用抑制消减杂交技术（SSH）在表达水平上进行分析，从而确定Willis环变异缺失相关基因。本研究将在比较医学层面为脑血管疾病风险评估提供重要依据，为深入研究脑血管畸形发生机制开拓新途径，也将成为长爪沙鼠Willis环变异缺失鉴定的有力工具。

脑血管畸形是脑血管病发生的高危因素。国内外的报道均表明长爪沙鼠脑底动脉Willis环存在多种变异缺失类型，提示长爪沙鼠脑底动脉Willis环是研究脑血管畸形的良好材料。我们前期研究发现Willis环的变异缺失类型有明显的遗传性，并与某些微卫星位点呈相关性。因此我们推断决定Willis环变异缺失的基因改变引起了连锁微卫星位点的多态性发生，通过这些位点可以找到相关基因。鉴于此，本课题开展了以下两部分研究工作：（1）通过已筛选出的137个微卫星位点对Willis环变异缺失不同表型的长爪沙鼠基因组进行相关性分析，经过127只动物验证后发现，有4个微卫星位点位点与Willis环的变异缺失高度相关，其中位点AF200941所扩增出的139bp差异等位基因片段在B型（前交完整后交缺失）与D型（前交完整后交完整）间存在显著性差异，相关系数为0.519，也就是说与后交类型显著相关；位点D6Mit37所扩增出的261bp差异等位基因片段在C型（前交缺失后交缺失）与D型（前交完整后交完整）间存在显著性差异，相关系数为0.400，即与前后交的缺失均相关；位点D16Mit7扩增出的480bp差异等位基因片段在B（前交完整后交缺失）组与C组（前交缺失后交缺失）间存在显著性差异，相关系数为0.423，即与前交缺失相关；位点D13Mit14扩增出的差异等位基因片段300bp在Willis环D型（前交完整后交完整）和B型（前交完整后交缺失）间存在显著性差异，相关系数达0.751，也就是说与后交通支类型显著相关。用不同Willis环类型的长爪沙鼠构建基因组文库，通过这些微卫星序列设计探针进行原位杂交，获得的阳性克隆测序，结果没有发现与血管发育相关的基因。（2）选取不同类型Willis环动物的脑底动脉及其周围组织提取mRNA，合成cDNA后进行抑制削减杂交（SSH），所获差异片段构建了不同类型Willis环差异基因SSH文库6个。对这些SSH文库进行测序后，共获得304个NCBI上已收录的基因，其中血管发育相关基因16个，经RT-PCR和Real-time PCR进一步验证后确定有4个基因在不同Willis环类型中的表达有显著差异，分别为profilin2、gpx4、cystatin C和GNAS。本研究的开展首次在长爪沙鼠中筛选出脑血管畸形相关基因4个，为深入开展脑血管畸形发生机制研究奠定了基础。