长爪沙鼠脑缺血模型近交系的培育及模型发生相关机制

长爪沙鼠的脑底动脉Willis环缺失类型不同导致模型成功率仅有30%-40%，不但影响实验结果，造成动物浪费，也有悖动物福利，而定向培育近交系将会有效解决这一难题。AGGF1和VEGF与血管发育和脑血管畸形密切相关，长爪沙鼠Willis环是先天畸形，我们推测这一畸形与AGGF1和VEGF的序列或表达差异有关。本研究拟在微卫星标记技术辅助下，将已近交8代的脑缺血高发长爪沙鼠培育成脑缺血模型近交系。同时将模型症状与Willis环缺失类型及脑损伤病理变化进行相关分析；克隆不同Willis环类型的AGGF1和VEGF，分析序列差异；通过RT-PCR检测AGGF1和VEGF在不同Willis环类型的表达差异。本研究是首次培育长爪沙鼠脑缺血高发近交系，对长爪沙鼠的开发与利用具有深远意义。同时有助于揭示脑缺血模型的发生机制，为深入研究脑血管畸形发生的分子机制提供依据，为人类脑缺血和血管发育研究提供材料。

本研究在原有近交F8代的基础上，用传统兄妹交配结合微卫星DNA检测的方法，定向培育长爪沙鼠近交系到F20代，成功建立了长爪沙鼠脑缺血模型近交系。长爪沙鼠单侧颈总动脉结扎(UCO)模型发生率F19已达100%，Willis环后交通支的缺失达到100%，前交通支的缺失率在F19达100%；父母Willis环一致率在F19代已达100%。对近交20代的长爪沙鼠进行了生化位点、微卫星DNA遗传标记和皮肤移植的遗传进行了检测，结果F20代26个生化位点均纯合，28个微卫星位点的纯合率达到92.86%，皮肤移植后在急性反应期没有发生免疫排斥。实验比对了脑缺血高发封闭群(IG)和普通群体(GG)模型发生率以及神经症状和神经损伤的关系。结果表明，UCO模型成功动物数在IG和GG中分别为65.0%和30.0%，二者有显著的统计学差异（P=0.000，＜0.01）。在UCO模型中，神经症状评分值与全脑神经损伤病理变化分级呈高度相关，IG的相关系数r值达0.9794，GG的相关系数r值达0.9429。即神经症状评分越高，神经损伤病理变化分级越低，存活的神经元数量越少。本研究用RACE法克隆了AGGF1和VEGFA的序列，其全长分别为1842bp和3181bp。通过RT-PCR和Western blotting检测AGGF1和VEGF在不同胚胎时期和出生后不同日龄动物心脏和脑中的表达水平发现，胚胎10d是2个基因的表达高峰期，因此我们选取了不同Willis环的10日龄胚胎进行了AGGF1和VEGFA表达差异分析，结果发现其中一个基因在不同血管类型个体中的表达水平没有显著变化，而另一基因在不同血管类型个体间存在差异（p＜0.01）。但在成年长爪沙鼠不同Willis环动物脑组织中，一个基因没有差异，而另一基因则表现出显著差异。另外我们还初步检测了7代近交系的生理生化指标，也表现出了与封闭群动物不同的特征。本研究是国内外首次培育的长爪沙鼠脑缺血高发近交系，对长爪沙鼠的开发与利用具有深远意义，为人类脑缺血和血管发育研究提供了珍贵材料。通过对神经症状和脑损伤的相关性研究以及对VEGFA和AGGF1这2个基因在不同Willis环类型胚胎和成年动物中的研究，有助于揭示脑缺血模型的发生机制，为深入研究脑血管畸形发生的分子机制提供依据。