蛋白质巯基亚硝基化调控不同类型肌纤维中钙蛋白酶活性的机制研究

Calpain activity and its proteolysis activity in different types of muscle fiber were different. However, studies about the mechanism of its difference were few. We will study the mechanism of calpain activity differences in different types of muscle fiber from the perspective of calpain S-nitrosylation. Technologies of histochemistry staining, western blot, HPLC and BSA combined with LC-MC/MC were used in this study. The correlationship between protein S-nitrosylation and muscle fiber type composition were studied to verify the effect of muscle fiber type on calpain S-nitrosylation statistically. To study the effect of muscle fiber type on calpain S-nitrosylation and its activity, S-nitrosylated calpain, calpain acitivity and its proteolysis activity in different types of muscle fiber were analyzed. The incubation model of calpain S-nitrosylation in vitro was established to understand the effect of calpain S- nitrosylation on its activity and proteolysis activity. This can uncover the mechanism of calpain activity in different types of muscle fiber regulated by protein S-nitrosylation.. Furthermore, this can reveal the mechanism of the differences of tenderness changes in different types of muscle, and improve the existing beef ageing mechanism.

宰后不同类型肌纤维中钙蛋白酶活性及其蛋白水解活性存在差异，但对其差异机制的研究较少，本项目将从钙蛋白酶自身的巯基亚硝基化角度研究宰后不同类型肌纤维中钙蛋白酶活性差异机制。项目将采用组织化学染色法、免疫印迹、高效液相色谱法和生物泛素置换法结合LC-MC/MC等研究方法，研究蛋白质巯基亚硝基化水平和肌纤维类型组成的相关性关系，从统计学角度明确肌纤维类型对蛋白质巯基亚硝基化的影响；研究宰后不同类型肌纤维中巯基亚硝基化的钙蛋白酶、钙蛋白酶活性及其蛋白质水解活性的变化，明确肌纤维类型对钙蛋白酶巯基亚硝基化及钙蛋白酶活性的影响；建立钙蛋白酶巯基亚硝基化离体孵化模型，验证钙蛋白酶自身巯基亚硝基化对其活性及蛋白水解活性的影响，从而揭示蛋白质巯基亚硝基化调控不同类型肌纤维中钙蛋白酶活性的机制，进而揭示宰后不同类型肌肉嫩度变化差异机制，完善宰后成熟理论。

宰后不同类型肌纤维中钙蛋白酶活性及其蛋白水解活性存在差异，但对其差异机制的研究较少，本项目从钙蛋白酶自身的巯基亚硝基化角度研究了宰后不同类型肌纤维中钙蛋白酶活性差异机制。项目研究了蛋白质巯基亚硝基化水平和肌纤维类型组成的相关性关系，背最长肌、半腱肌和腰大肌3部位的肌纤维类型组成存在差异，腰大肌具有更高比例的I型肌纤维，半腱肌具有更高比例的IIB型肌纤维，背最长肌具有更高比例的IIA纤维；IIB型肌纤维直径和面积高于I型肌纤维。背最长肌和半腱肌的SNO含量高于腰大肌，nNOS含量为腰大肌>背最长肌>半腱肌。宰后成熟能够改善牛肉嫩度，而巯基亚硝基化程度、蛋白质降解程度随着成熟时间延长而增加。此外，SNO含量与肌原纤维小片化指数呈正相关，与新切面的a*呈负相关。研究了宰后不同类型肌纤维中巯基亚硝基化的μ-钙蛋白酶、μ-钙蛋白酶活性及其蛋白质水解活性的变化，背最长肌中μ-钙蛋白酶的亚硝基化水平高于腰大肌，成熟过程中I型肌纤维中Troponin T的30kDa降解条带浓度高于II型肌纤维，I型肌纤维中desmin的主条带浓度高于II型肌纤维。为进一步验证蛋白质巯基亚硝基化对μ-钙蛋白酶活性及肌原纤维蛋白的影响，利用转亚硝基化方法（GSNO）建立μ-钙蛋白酶的巯基亚硝基化离体孵育模型，不同浓度的GSNO均能抑制μ-calpain的自溶，使其活性降低，降解肌钙蛋白T和肌间线蛋白的能力下降。综上所述，蛋白质巯基亚硝基化可调控μ-calpain的活性，影响其对肌原纤维降解的能力，进而影响成熟过程中牛肉品质变化。该项目揭示蛋白质巯基亚硝基化调控不同类型肌纤维中钙蛋白酶活性的机制，进而揭示宰后不同类型肌肉嫩度变化差异机制，完善宰后成熟理论。