PCSK9联合多指标筛查神经管畸形无创性产前标志物研究及其机制探讨

In previous study, we employed an iTRAQ-based quantitative proteomic approach to analyze the proteomic changes in the sera samples of pregnant rats with neural tube defects (NTDs) fetuses in early stage of malformation. From the analysis of proteome data, a total of 66 proteins displayed significant differential expression. The candidate protein PCSK9 was then validated in maternal blood samples and exhibited a high specificity and sensitivity as a single diagnostic biomarker of NTDs. Therefore, we will perform a MRM-based targeted proteomic approach in maternal blood and further evaluate clinical value of a biomarker panel composed of PCSK9 and other candidate proteins for noninvasive prenatal diagnosis of NTDs. Also, we will measure the protein level of biomarker panel in maternal serum in the early stages of pregnancy in order to evaluate the early diagnostic efficacy before anomalies are found with the imaging examination. We intend to establish the new screening program with high sensitivity and high specificity and guide the early diagnosis and early intervention of NTDs. Additionally, in previous study, we found PCSK9 expression was significantly decreased in spinal cords and placentas in NTD rat fetuses. So we speculate that PCSK9 may involve in the pathogenesis of NTDs. In this project, we will apply interaction proteomics technology to investigate the substrates of PCSK9 in the neural development of embryo and explore the mechanisms involved in NTDs. The discovery may shed new light on NTD prevention studies.

前期研究利用iTRAQ技术在神经管畸形早期孕鼠血清筛查出66种差异表达蛋白质，经在临床神经管畸形孕妇血清中进一步验证，首次发现PCSK9作为神经管畸形产前诊断标志物有较好的特异性和敏感性。因此，本课题将在前期研究基础上利用MRM靶向蛋白质组技术对神经管畸形母亲的血清进行检测，进一步明确PCSK9与其它候选蛋白标志物组合在神经管畸形诊断的临床价值，同时收集孕早期孕妇血清标本进行检测，以研究影像学检查发现结构异常之前进行早期筛查的临床价值，探索建立高敏感度、高特异性的筛查新方案，以指导该疾病的早期诊断和干预。同时前期研究进一步发现PCSK9在神经管畸形大鼠胚胎脊髓及胎盘组织表达明显降低，提示PCSK9可能参与神经管畸形发生。本课题将采用相互作用蛋白质组学研究技术，研究PCSK9在胚胎神经发育过程中作用底物，探讨其参与神经管畸形的作用机制，为防治神经管畸形提供新的思路。

神经管畸形是常见的小儿先天神经管发育畸形。目前NTDs的产前诊断主要依靠孕中期产前超声检查，明确诊断时胎儿已经出现明显的结构发育异常，失去早期治疗和干预的最佳时机。目前畸形的发病机制并不清楚，是环境因素和遗传因素共同作用的结果，属于复杂的多基因疾病，尚无良好的预防和治疗措施。因此，研究神经管畸形的早期无创性产前诊断标志物，使其诊断不受影像设备和技术水平限制，同时获得神经不可逆损伤之前的早期诊断方法及其胚胎发生机制的深入研究，将会为神经管畸形的早期预防和治疗提出新策略。本课题完成了先天畸形胎儿孕妇血清标本收集工作。利用iTRAQ蛋白质组学技术比较了神经管畸形胎儿母亲血清与正常孕妇血清的差异表达蛋白质，发现23种蛋白的表达差异倍数在1.5倍以上，比较神经管畸形早期孕鼠血清差异蛋白表达谱，发现66种蛋白的表达差异倍数在1.5倍以上。采用ELISA方法对5种补体蛋白（C1QA、C1S、C1R、C9和C3）和1个与神经调节因子受体LIFR进行了验证，发现C3、C9、LIFR结合PCSK9是神经管畸形产前诊断的潜在分子标志物。利用神经管畸形动物模型，分析了不同胚胎发育期正常胚胎和神经管畸形胚胎LIFR、PCSK9的时空表达规律，提示LIFR、PCSK9可能在神经管发育时期扮演了特殊的作用，LIFR、PCSK9表达的减少可能参与神经管畸形的发生。应用PCSK9抑制剂协同维甲酸致胎鼠畸形，发现在相同维甲酸剂量下，使用PCSK9抑制剂可以增加胚胎的畸形率与死胎率，并且应用PCSK9抑制剂后，神经管畸形组胎鼠脊髓中LDLR表达增加，从而探究了PCSK9对胚胎神经管发育的影响及作用机制。