棘阿米巴丝氨基代谢通路的分析及其调控研究

The serine and cysteine metabolisms play an essential role in the survival and pathogenesis of Entamoeba histolytica, however little has been clarified in such metabolic pathway in Acanthamoeba at present. Our previous work demonstrated the existence of two rate-limiting enzymes in the serine metabolic pathway of Acanthamoeba, and a series of experiments illustrated serious impact on the survival and proliferation of the protozoan when its serine synthesis is inhibited. Therefore, we hypothesize that the serine metabolism is one of the core metabolism of Acanthamoeba, which first controls the synthesis of downstream amino acids, then regulates the expression related proteases, and finally affects the biological characteristics and pathogenicity of Acanthamoeba. The present proposal base on previous studies and focus on further studies of overall perspectives and functions of Acanthamoeba’s serine metabolic pathway, methods or techniques such as proteomics, latest mass cytometry, RNA interference or gene overexpression etc. will be applied. Our objectives in the proposal conclude clarifying the function of the rate-limiting enzymes in serine metabolic and their role in the regulation of cysteine metabolism, making clear the effects of serine metabolism on the expression of related proteases and their following influence on survival, growth, antioxidant, attachment to host cell, pathogenic mechanism of Acanthamoeba. The proposal aims at providing new theoretical bases in growth mechanism and pathogenesis of Acanthamoeba, which may be extremely beneficial to the early diagnosis, development of effective drug and prevention of the high-risk population during Acanthamoeba’s infection.

已经证实丝氨酸和半胱氨酸代谢对溶组织内阿米巴的生存和致病有至关重要作用，但是对棘阿米巴的相关代谢通路目前还知之甚少。我们前期的工作证实棘阿米巴丝氨酸代谢通路上的两个限速酶的存在；同时一系列的实验结果也发现虫体丝氨酸合成受到抑制后，严重影响了虫体的存活及生长。因此我们假设丝氨酸代谢是棘阿米巴代谢枢纽之一，调控下游氨基酸的合成，进而调节相关蛋白酶的表达，影响棘阿米巴的生物学特性和致病性。本课题拟在前期的研究基础上，应用蛋白质组学、质谱流式细胞术、RNA干扰或转染过表达等多种技术深入研究棘阿米巴丝氨酸代谢通路的性质和功能，证明代谢限速酶的作用及其对半胱氨酸合成代谢的调控的方式，探索丝氨酸代谢对相关蛋白酶表达的影响以及阐明其影响棘阿米巴的生存生长、抗氧化、附着乃至致病的机制。为棘阿米巴的生长机制和发病机理提供新理论依据，从而为棘阿米巴感染的早期明确诊断、有效治疗药物的筛选和高危人群的预防奠定基础。

棘阿米巴是自生生活的原虫，感染人体后可引起棘阿米巴角膜炎，在免疫抑制的人群中还可引起肉芽肿性阿米巴脑炎和阿米巴慢性皮肤溃疡等疾病。对人类健康已造成新的威胁，是重要的公共卫生问题。本课题研究棘阿米巴丝氨基代谢通路的分析及其调控，探讨棘阿米巴原虫的凋亡特征，同时研究滋养体半胱氨酸合成途径及上游丝氨酸代谢的非磷酸化代谢通路的特征，深入探究与其代谢相关的致病蛋白的特点，筛选出具有致病作用的蛋白酶，并探讨了该致病蛋白酶导致宿主细胞病变的作用机制。应用酶的基因克隆、抗体制备、激光共聚焦显微镜观察等方法研究棘阿米巴滋养体半胱氨酸合成通路及上游丝氨酸代谢的非磷酸化代谢途径的特征。应用激光共聚焦显微镜观察滋养体经脂肪酸处理后，caspase-3蛋白的活化水平；流式细胞术分析滋养体经外源性脂肪酸处理后，细胞膜磷酯酰丝氨酸的外翻水平和实时荧光定量PCR检测滋养体中凋亡相关蛋白及自噬相关蛋白的表达水平。RNA干扰、抑制剂应用、基因重组等技术深入研究与棘阿米巴滋养体丝氨酸或半胱氨酸代谢相关的致病蛋白的特点。应用siRNA干扰棘阿米巴CP3蛋白酶的表达，将经siRNA干扰CP3蛋白酶表达后的滋养体与人角膜上皮细胞（human corneal epithelial cell，HCEC）共孵育，显微镜观察各处理组中HCEC细胞的病变程度； CCK-8检测各组中HCEC细胞的活力。实时荧光定量PCR检测各组HCEC细胞中，PARs蛋白，及Ras家族蛋白的mRNA表达水平。Western blot分析各组HCEC细胞中，PARs蛋白下游的PI3K/Akt信号通路，及Ras蛋白下游的Raf/Erk/p53信号通路的活化水平。.综上，研究证明棘阿米巴存在由CS参与的半胱氨酸合成途径和由GDH、SPAT参与的丝氨酸代谢的非磷酸化途径。由于人体中缺乏CS基因，棘阿米巴CS还可作为抗棘阿米巴感染药物的靶点。半胱氨酸蛋白酶家族蛋白在虫体致病过程中发挥重要作用。而半胱氨酸作为半胱氨酸蛋白酶的中央活性残基，可能影响滋养体半胱氨酸蛋白酶的水解活性，从而影响虫体的致病力。为棘阿米巴的生长机制和发病机理提供了新理论依据，为有效治疗药物的筛选和高危人群的预防奠定基础。.