Wnt和Notch信号通路在脂肪间充质干细胞向光感受器细胞分化中的作用和机制研究

视网膜干细胞移植是治疗视网膜病变切实可行的方法，然而如何对移植后干细胞进行调控，促进其分化仍是该领域中亟待解决的问题。既往研究证实，Wnt和Notch两个信号通路在视网膜胚胎发育过程中起着关键的作用。本实验拟第一步采用RNAi技术，RT-PCR，Western blot及流式细胞仪等方法，在体外研究Wnt和Notch信号通路在脂肪间充质干细胞向光感受器细胞分化过程中的作用和机制；第二步使用可降解生物材料PLLA/PLGA共聚物作为移植载体，将Wnt和Notch信号通路调控因子制成缓释微球和脂肪干细胞一起移植入RCS大鼠的视网膜下腔，在体内研究两个信号通路对干细胞定向分化的影响，同时探讨信号通路调控因子缓释微球技术和可降解生物材料作为干细胞载体的移植技术的可行性。本课题将在干细胞来源、移植方法及移植后调控等方面为视网膜干细胞移植技术提供新思路和突破点。

视网膜色素变性是临床上常见的视网膜病变类型，此外还有很多遗传性以及获得性视网膜疾病可因为视网膜细胞的丧失而导致视功能的损伤。既往研究已经证实，视网膜干细胞移植是视网膜替代和再生治疗中极具前景的方法。Müller 细胞是哺乳动物视网膜中最主要的神经胶质细胞，在胚胎发育过程中与视网膜的神经元细胞有着共同的干细胞来源，作为视网膜源性的干细胞来源， Müller 胶质细胞和视网膜神经元细胞同来源于神经外胚层，有着广阔的临床应用前景。.对视网膜 Müller 细胞的原代培养方法加以改良，细胞传3代后，进行免疫荧光组织化学（IF）鉴定。荧光显微镜下分别可见97.2 ± 1.43%, 90.3 ± 2.17%的细胞 GS和Vimentin 染色阳性，即表明原代培养的细胞为Müller胶质细胞。分别取第2代及第3代的细胞做流式细胞分析(FACS)，第2代细胞中87.8% 的细胞GS表达阳性，而传至第 3 代后则99.7% 的细胞GS表达阳性，即表明培养的细胞中Müller 细胞已经达到很高的纯度。.通过更换无血清去分化培养基行悬浮培养，可见与神经干细胞特有的神经球类似的形态出现，且传2代的细胞依旧具备自我克隆的能力。细胞球形行IF检测，可见细胞球Nestin, Musashi-1, Pax6均为染色阳性。但去分化的细胞仍然可见GS表达阳性。FACS检测，通过去分化培养后，细胞球中表达Pax6 阳性的细胞为80.2% ，表达Nestin 阳性的细胞为 60.4%；GS阳性细胞由98.6% 下降至 62.7%。.RT-PCR检测神经球样细胞中Wnt 和Notch 通路相关基因的mRNA 水平较Müller细胞明显升高，其中Fzd1、Fzd2、 Lef1、Notch1、Delta1及Hes1分别为~2.44 、 ~2.82 、~4.62 、~3.24 、~2.64 及~5.71 倍，差异具有统计学意义(p＜0.05)。Western blotting 结果显示，从d0 到d5，Wnt2，β-catenin，Notch1，Pax6 和Nestin 蛋白的表达逐渐增强，通路相关蛋白Wnt2，β-catenin 及Notch1 与干细胞标志物Pax6 及Nestin 的表达存在时间的一致性。FACS 结果显示，在Wnt-3a + Notch1 、Wnt-3a 和Notch1组中，Pax6 阳性