Notch和Wnt信号对鹿茸间充质干细胞自我更新与软骨分化的调控机制研究

Deer antler mesenchymal stem cells(MSC) are a newly discovered stem cell that is unique to deer. And it provides an excellent model to study microenvironmental effects on somatic stem cell proliferation and chondrocytes differentiation except bone marrow mesenchymal stem cells. In the process of deer antler growth the antler MSC differentiate into chondrocytes constantly to promote antler growth, however the MSC also continue to proliferate in order to maintain the pool of stem cells. Regulation of MSC proliferation and differentiation by the Wnt and Notch signaling pathways is responsible for the antler's characteristic rapid growth but somehow avoids the formation of cancer which would be expected in other tissues dividing so rapidly. In my study Xinjiang Wappti antler MSC will be 3D cultured and induced in vitro. Its cells phenotype will be identified by Flow Cytometry. The result could be an experiment supportor for inducing deer antler MSC differentiation into chondrocytes in vitro . Methods such as westernblot, realtime PCR and RNAi could then be used to study the effect of Notch and Wnt signaling pathways on chondrocytes differentiation from antler MSC,and the functional mechanism of Notch signaling pathway and the molecular mechanism that homeostasis of MSC proliferation and differentiation will be elucidated. It also will provide an experimental model for experimental therapy of human bone diseases by testing different compounds/proteins ability to induce the formation of cartilage from deer antler MSC.

鹿茸间充质干细胞是一类新的干细胞，是除骨髓间充质干细胞外研究成体干细胞体外诱导软骨发生极好的模型。在鹿茸生长发育过程中，它一方面能够不断增殖更新干细胞库，还能够不断向软骨分化，维持鹿茸类似肿瘤的快速生长却不发生癌变，这种特性与微环境中Wnt 和Notch信号通路对间充质干细胞的调控密不可分。本研究以新疆塔里木马鹿茸间充质细胞为材料，通过三维细胞培养和诱导，鉴定其干细胞表型特征，为体外培养和诱导软骨生成提供实验依据；利用蛋白印迹法、实时定量PCR及RNAi等技术，研究Notch信号对间充质细胞向软骨分化的作用，初步揭示该信号对软骨分化作用机制；在上一个基金对c-myc基因的研究基础上，研究Notch和Wnt信号在诱导软骨发生过程中的相互作用关系，揭示鹿茸间充质细胞增殖分化自我平衡的分子机制，为鹿茸快速生长机制提供理论支持，同时为以鹿茸间充质细胞诱导骨生成作为人类骨病治疗提供实验材料和线索。

茸间充质干细胞是一类新的干细胞，在鹿茸生长发育过程中，它能够不断增殖更新干细胞库，还能够不断向软骨分化，维持鹿茸生长。鹿茸类似肿瘤的快速生长却不发生癌变的特性，与微环境中Wnt 和Notch信号通路对间充质干细胞的调控密不可分。鹿茸间充质干细胞成为研究微环境下干细胞软骨诱导分化极好的模型，对研究微环境对干细胞增殖分化平衡机制有重要的作用。本研究以新疆塔里木鹿茸间充质细胞为材料，建立了三维细胞体外培养和软骨诱导分化模型；发现利用外源TGFβ1成功诱导鹿茸间充质干细胞（MSCs）能够向软骨分化，表面标志物II型胶原与蛋白聚糖表达显著；鹿茸MSC到软骨细胞的分化过程，诱导至第14 d细胞为具有分泌软骨基质能力的软骨细胞，第35 d软骨细胞完成终末分化进入钙化期，此模型很好的模拟了鹿茸膜内成骨和软骨内成骨两种成骨方式。.利用体外鹿茸MSCs软骨分化模式，研究了Wnt家族生长因子及信号通路关键基因的表达变化。结果表明在软骨分化过程中仅检测到Wnt3、wnt4和wnt5A 3 个Wnt家族生长因子的表达；从基因的表达趋势，表明Wnt3与wnt5A的表达对鹿茸软骨的发育有重要的影响。Wnt信号通路在鹿茸软骨发育的关键时期DKK1基因高表达，而β-catenin作为信号通过的枢纽在该时间点下调表达。利用DKK1超表达阻止Wnt信号，结果鹿茸MSCs向软骨分化进程被加快，表明了Wnt/β-catenin经典通路对塔里木马鹿茸MSCs软骨分化起重要的调控作用。过表达DKK1基因结果还发现，对原癌基因c-myc基因的表达水平没有影响，同时对鹿茸MSCs的增殖活动没有影响，初步认为该信号不直接调控鹿茸MSCs的增殖，不影响c-myc基因的表达水平。同时检测了Notch信号通路关键基因的表达变化，发现notch-1、notch-2、notch-4、dll-4、jagged-2、CBF-1、hes-1、hes-5等在鹿茸MSCs中均有不同程度的表达，但在鹿茸MSCs软骨分化过程jagged-1介导的Notch信号可抑制分化进程；发现Notch通路的激活可抑制Wnt β-catenin通路，从而抑制成骨细胞的分化。从研究结果说明Wnt和Notch两信号通路共同参与了鹿茸的生长与发育活动，并经由下游原癌基因C-myc等表达变化维持其骨分化平衡。