Tip49a/Tip49b及其相关复合物的冷冻电镜结构研究

Tip49a and Tip49b are two structurally and functionally highly related proteins that belong to the AAA+ (ATPase Associated with diverse cellular Activities) superfamily. They are existed in many species of which ranging from yeast to human. Both Tip49a and Tip49b are conserved components of various multi-subunit complexes, which are linked to a wide range of cellular processes, such as DNA damage response, transcription regulation, snoRNP biogenesis and ATP-dependent chromatin remodeling. Despite their diverse roles, there is no available high resolution structure of full-length Tip49a/Tip49b protein complex. The mainly purpose of our research is to reveal the high resolution structures of dodecameric Tip49a/Tip49b and determine their functions in two larger complexes which containing them, R2TP and Tip49a/Tip49b-nucleosome complex, by using cryo-EM single particle analysis combining with biochemical and biophysical techniques. Our research will provide insights into the structural basis of Tip49a/Tip49b in mediating snoRNP biogenesis(R2TP complex) and ATP-dependent chromatin remodeling(Tip49a/Tip49b-nucleosome complex).

Tip49a和Tip49b是AAA+超家族的两个蛋白，它们保守地存在于从酵母到人的多个物种中，在细胞内通常以复合物的形式存在。它们在DNA损伤修复、转录调控、snoRNP成熟、染色质重塑等生命活动中发挥重要的调控作用，但迄今为止仍然没有Tip49a/Tip49b全长蛋白相关复合物的结构报道。本研究拟主要应用冷冻电镜单颗粒三维重构技术解析人源Tip49a/Tip49b及其参与形成的两种高级复合物（R2TP、Tip49a/Tip49b-核小体）的高精度三维结构，并结合生化实验确定Tip49a/Tip49b在两种高级复合物中的作用。本项目的研究成果将为理解Tip49a/Tip49b在snoRNP组装（R2TP复合物）和ATP依赖的染色质重塑（Tip49a/Tip49b-核小体复合物）中的工作机制提供可靠的结构信息。

染色质重塑复合物是一类可以改变染色质局部结构的多亚基复合物。AAA+家族成员Tip49a/Tip49b蛋白存在于许多染色质重塑及其它重要生物学过程相关复合物中。我们利用冷冻电镜单颗粒技术解析了大肠杆菌中共表达的全长人源Tip49a/Tip49b蛋白十二聚体复合物3.6 Å分辨率的冷冻电镜结构。我们的结构显示该复合物由两个六聚体环状结构以“尾对尾”的方式组成。与Domain II（结构域II，DII）截短的Tip49a/Tip49b所表现出的异聚形式的晶体结构不同，全长Tip49a/Tip49b复合物两个六聚体分别只由Tip49a或Tip49b构成，即每个六聚体都是由单一亚基聚合而成的。Tip49a和Tip49b六聚体之间通过DII之间的相互作用形成十二聚体。我们通过抗His tag抗体标记Tip49b亚基（N端带有六个His tag）、Trx（thioredoxin，硫氧还蛋白）tag标记Tip49a实验以及分析更高级复合物-R2P复合物（由Tip49a/Tip49b/PIH1D1三个亚基组成）的结构组成，确认了我们的全长Tip49a/Tip49b复合物同聚模型。通过进一步构建DII外侧区域的删除突变体，我们发现，如果只将Tip49a或Tip49b一种亚基的DII外侧区域截除，大部分颗粒仍然表现为同聚组装形式；但是，如果将Tip49a和Tip49b的DII外侧区域都删除，则会使大部分十二聚体颗粒以异聚形式组装，与同样截短突变的晶体学解析的十二聚体结构组装形式相同。此外，我们还通过点突变实验鉴定了DII上四对氨基酸残基是介导Tip49a和Tip49b相互作用的关键残基。